植物品种鉴定MNP标记法征求意见稿编制说明

《植物品种鉴定MNP标记法征求意见稿编制说明》由会员分享，可在线阅读，更多相关《植物品种鉴定MNP标记法征求意见稿编制说明（26页珍藏版）》请在装配图网上搜索。

1、植物品种鉴定MNP标记法国家标准编制说明（征求意见稿）一、任务来源本国家标准的制定任务列入国家标准化管理委员会2017年第二批国家标准制修订计划，项目编号“20171813-T-424”。本项任务由中国标准化研究院提出并归口，定于2019年完成。本标准起草工作组由江汉大学等单位共同组成。二、目的和意义（一）国内外研究现状与存在的问题1、植物品种真实性鉴定植物品种鉴定分为田间性状鉴定与分子鉴定两种方法，田间性状鉴定称为DUS测定,即特异性、一致性和稳定性鉴定。我国种子法对依据田间性状表现对品种进行定义，因此，田间性状鉴定具有最终的法律效力。目前，我国田间测试的国家标准或者行业标准已经涵盖191种

2、农作物和206种林木。国际上主要的品种鉴定机构包括国际植物新品种保护公约组织（UPOV）和国际种子联合会（ISF），他们的制定的田间性状鉴定标准涵盖了近700种植物。虽然田间鉴定是品种鉴定的金标准，但田间鉴定需要种植2-3个生长季节，周期需要2-3年甚至更长的时间。田间鉴定的结果中包含了环境的影响，不能够完全反应品种遗传的因素。分子鉴定技术可以克服田间鉴定的不足，具有快速且不受环境影响的优势，被逐步用于植物品种鉴定中。早期的分子标记鉴定方法采用蛋白标记法，但由于蛋白标记可用特征少，已基本被放弃。后期分子标记逐步发展为DNA分子标记。在DNA分子标记中，早期有RAPD标记法、ISSR标记法、RF

3、LP标记法、AFLP标记法等。早期的这些DNA标记法具有分型不稳定、基因型过多无法分辨、非共显性等缺陷，基本上都没有被纳入品种鉴定标准。经过数十年的植物品种鉴定标准的发展与实践，只有SSR标记法和SNP标记法被保留了下来。SSR标记法的主要优点在于多态性高和共显性。同时，SSR标记法可以在普通的实验室通过电泳的方法进行检测，获得了迅速的推广。现有的大部分植物品种鉴定标准都是基于SSR标记法建立的。然而，聚合酶在扩增SSR标记中的简单重复序列时，存在“滑动”现象，导致产生大量的不存在的错误基因型；SSR标记法依据片段长度进行检测，但电泳方式很难精准判定片段长度，为了进行品种间的准确比较，需要将待

4、测样品与对照样品在同一个电泳胶上的相邻泳道上进行电汸检测，称为平行实验。很多品种鉴定需要与成千上万的已知品种进行比较，比如近似品种的筛选、品种权侵权对象的认定、实质性派生品种判定等工作，要求结果精准就意味着需要无数次平行实验，不具有现实的可行性。基于SSR标记法存在的问题，SNP标记法在近年来被提出且被逐步用于了植物品种鉴定的标准中，如水稻品种鉴定标准。SNP标记法获得的是具体的碱基序列，因此，不需要平行实验，可以同时比对上千个品种，改进了SSR标记法的缺陷。然而，SNP标记法也有自身固有的缺陷。首先，不同于SSR标记，SNP标记是二态性标记，单个标记位点区分力有限。第二，由于单个SNP标记位

5、点区分能力有限，需要检测大量的SNP标记位点才能实现品种区分的目标，因而需要高通量的检测手段，例如基因芯片。基因芯片生产工艺复杂，需要一次合成大量的芯片才能降低单位成本，不适合普通实验室或者小作物等中使用，推广应用范围受到了限制。除SSR标记法与SNP标记法各自的缺陷外，它们还具有一些共同的不足。第一，准确性问题。SSR标记法存在7%左右的错误率，SNP标记法的错误率低于SSR标记，为1%左右，也有报道为2%甚至在杂交种中，可以达到6.7%。然而，由于SNP标记法检测位点多，即使是1%的错误率，错误位点数量也较大，可能严重影响品种鉴定结论。第二，污染问题。SSR标记法与SNP标记法都需要PCR

6、扩增富集标记位点，由于这两种方法采用染色或荧光信号显示标记位点的等位基因型，因此，需要较多的扩增产物和较大的PCR循环数，比如30个循环以上。大量的扩增产物对实验室空气造成污染，称之为气溶胶。大量气溶胶又容易掉入PCR反应中，加之PCR循环数多，少量的气溶胶可能被大量扩增，被检测出来产生错误的基因型。由于SSR标记法与SNP标记法都无法定量检测，加剧了错误基因型被检测的可能性，加剧了错误的基因型出现的频率。第三，操作与实验室要求问题。为了避免无处不在的气溶胶，对实验室洁净级别与实验操作要求都极高，限制了SSR标记法与SNP标记法在普通实验室与普通操作人员中使用。2 实质性派生品种鉴定品种B来源

7、于原始品种A且与原始品种A差异不大时，品种B就成为了原始品种A的实质性派生品种。简单地理解，同质化严重的品种为实质性派生品种。实质性派生品种制度要求实质性派生品种及其产品在生产、运输、销售与加工过程中与原始品种权人分享权利。因此，实质性派生品种制度的本义是保护原始创新，限制同质化品种。中国目前没有实行实质性派生品种制度，因此，只需要对原始品种稍作改变，即使这种改变没有任何进步意义，也可以获得与原始品种权人相同的权利。例如，仅通过简单的回交育种或者诱变育种的方式，改变了原始品种的颖尖颜色，就可以获得与原始品种权人一样的权利，“窃取”原始品种权人几年甚至是几十年的努力。这是导致中国目前品种同质化严

8、重，育种水平徘徊不前，整体落后于国外发达国家的重要原因。世界上已有有70多个国家或组织实行了实质性派生品种制度，中国是仅有的少数两三个没有正式实施这一制度的国家。可喜的是，中国已经投入实际行动，准备试行这一制度。实行实质性派生品种制度的前提是要有实质性派生品种判定的方法与标准，但中国目前实质性派生品种判定的方法与标准，严重阻碍了这一重大农业制度的实施与安排。（三）项目的意义为了充分解决现有标准中所采用的SSR标记法和SNP标记法所存在的问题，以及解决中国缺乏实质性派生品种制度实施所必须的实质性派生品种鉴定方法与标准的问题，本标准综合了分子生物学、计算机科学、统计学的知识与原理，发明了MNP标记

9、法，用于品种真实性鉴定与实质性派生品种鉴定。MNP标记法具有以下优势：（1）等位基因型丰富。MNP标记有多至2n种等位基因型（其中，n为MNP标记中的SNP标记的数量），远大于SNP标记的21=2种等位基因型，具有SSR标记等位基因型数量丰富的特点，品种区分能力强。（2）避免了SSR标记的局限。MNP标记中没有SSR标记的简单重复序列，避免了PCR扩增时产生的“滑脱”错误；MNP标记法获得的是碱基序列，十分标准，不同实验条件下的结果间可以自由且准确的比对。（3）避免了SNP标记的局限。在混合DNA分型中，MNP标记出错的概率为各个SNP标记同时出错的概率，错误率低且灵敏度高。MNP标记等位基因

10、型丰富，品种区分能力强，品种鉴定时需要的MNP标记数量少，减少了出错标记的数量，可以采用成本较高的测序技术进行检测，避免了SNP芯片杂交背景引起技术误差。（4）可以定量。同一个MNP标记位点利用二代高通量测序技术重复抽样检测了数百个测序片段，可以定量等位基因型比例、转基因含量、多倍体基因剂量等。（5）效率高。一次PCR反应同时扩增了数百个MNP标记位点；一次高通量测序可同时检测数百个样本的数千个MNP标记，效率极高。例如，我们2个人10天内检测了600份早稻DNA样本的700个标记位点。（6）品种真实性鉴定中的核心引物、扩展引物和实质性派生品种鉴定方法合为一体。UPOV和ISF等组织利用遗传相

11、似度判定实质性派生品种，其核心是要求检测的标记位点数量足够且多态性高，才能准确计算遗传相似度。MNP标记法具有多态性高的特点，同时，MNP标记法检测效率高，本标准中为每一个作物规定了500个以上的标记位点。因此，本标准中规定的品种真实性鉴定方法与实质性派生品种鉴定方法合二为一，统一了标准，同时为我国实质性派生品种制度的实施奠定了技术基础。基于以上技术特点，MNP标记法具有准确、高效、通用等特点，可以用于植物品种权精准授权、打假与维权，为种子法的实施提供了可靠的标准手段。将品种真实性鉴定与实质性派生品种鉴定合二为一，有助于规范了种业知识产权、市场秩序、提升中国种业育种水平和国际竞争力。三、标准制

12、定原则（一）标准编制原则1、高度可重现性利用标准中的方法获得的结果高度可重现，确保不同实验室的结果可以进行精准比较。2、高效性一个人利用标准中的方法在一周内，可以鉴定数百个品种，每个品种鉴定数千个位点。3、通用性在品种真实性鉴定与实质性派生品种鉴定中通用。将品种真实性鉴定的核心引物与扩展引物合二为一。在多种植物中通用，包括自花授粉植物、异花授权植物、常异花授粉植物、二倍体植物、多倍体植物、农作物、园艺植物、果树、中药等。（二）标准制订主要依据1、标准编写遵循GB1.1-2009标准化工作导则第1部分：标准的结构和编写规则的有关要求。2、标准编写内容参考我国相关的法规、标准，包括种子法，以及水稻

13、、玉米、小麦、马铃薯等农作物品种的SSR标记与SNP标记鉴定的行业标准或国家标准。四、标准主要技术内容（一）MNP标记筛选在标记筛选中，遵守扩增区多态性高、引物区保守、扩增区尽量选择单拷贝区域、在不同品种中的缺失率低等引物筛选的通用原则；引物在参考基因组上的扩增长度不超过250 bp等其它特殊要求。（二）样品类型在正常体细胞组织中，父母本等位基因型拷贝数多为1:1，因此，均容易被检出。在种子胚乳中，父母本等位基因型拷贝数多为2:1，因此，母本等位基因型容易在检测中丢失。为了避免这一问题，样品类型宜选用叶、根、茎、胚等以体细胞倍性为主的幼嫩且新鲜的样本，也可以选用种子。但种子中由于等位基因型拷贝

14、数不均衡，更可能出现等位基因型丢失。幼嫩且新鲜的组织提取的DNA量大且不容易降解，因此应该优先考虑。（三）样品纯度已有的国家标准中，本标准适用范围中的所有作物的种子纯度都不低于95%，本标准的要求与国家标准对大田用种的纯度要求保持一致，以避免杂种子对分型结果的影响。（四）实验操作本标准中多重扩增循环数在20个以下，处于线性增长期。采用二代高通量测序对扩增的线性产物进行检测，可以实现等位基因型间的相对定量。利用定量结果，可以排除实验室的气溶胶污染。因此，本标准对防止气溶胶的污染要求并不是十分严格，只要求实验分区、单向流动、设备器具专用且保持通风，这些要求在普通实验室可以满足，降低了本标准实施条件

15、的要求，使得本标准可以在更多实验室更方便地实施。（五）多重PCR扩增循环数根据的我们的大量实验的结果，PCR循环数20个时，等位基因型的比例在重现性实验中保持稳定，避免了由于等位基因型消失造成的实验不可重现性，因此，本标准规定多重PCR循环数20个。（六）测序量与质量控制我们利用本标准的方法，从2016年到2019年鉴定检测了1万多个植物品种样本。当将平均测序量设置为700倍以上时，95%以上的样品的平均覆盖倍数都可以达到规定的500倍。当平均覆盖倍数达到500倍及以上时，99%以上的样品在一次实验中，R1或R2的值可以达到95%及以上，以保证在以上参数的规定下，绝大部分品种鉴定实验可以一次性

16、地通过测序数据量质量控制。图一到图八列了几种具体物种在几千个品种的检测中，测序片段数与R1（纵坐标）之间的关系。图一、龙眼的测序片段数量和标记位点的检出率。（注：横坐标为品种）图二、蕃茄的测序片段数量和与标记位点的检出率。（注：横坐标为品种）图三、棉花的测序片段数量和与标记位点的检出率。（注：横坐标为品种）图四、荔枝的测序片段数量和与标记位点的检出率。（注：横坐标为品种）图五、玉米的测序片段数量和与标记位点的检出率。（注：横坐标为品种）图六、水稻的测序片段数量和与标记位点的检出率。（注：横坐标为品种）图七、黄瓜的测序片段数量和与标记位点的检出率。（注：横坐标为品种）图八、谷子的测序片段数量和与

17、标记位点的检出率。（注：横坐标为品种）对于水稻、玉米、棉花等作物来说，其基因组的大部分变异信息是已知的，因此，实验大多可以一次达到不低于95%的位点检出，其部分实例见图一至图八。不论是SSR标记法、SNP标记法还是MNP标记法，都依赖于PCR扩增，因些，可能存在一些品种因为来源特殊，基因组DNA的序列变异较多，导致较多的扩增引物与基因组不匹配，不能扩增，因此，不能简单地规定必须每个品种检测出位点都要不低于95%以上，那样从原理上就会导致一定有某些特殊的品种无法应用本标准。之所以希望检出位点的比例不低于95%以上，是为了防止在不同的实验中，检出位点变异较大，从而导致遗传相似系数计数在不同实验中相

18、差较大，最终导致品种鉴定结论由于位点抽样的原因导致偏差较大。为了防止这一问题，本标准规定了样品测序数据对样品的标记位点的平均测序覆盖倍数不低于500倍，此时，测序的抽样误差已经很少，PCR扩增成功的位点基本被检出，可以保证不同实验的检出的标记位点基本没有抽样误差，但为了更加保险，本标准对于检出的标记位点低于95%的样品，要求从DNA提取开始重新实验，以模拟不同的实验，要求在两次不同的实验中，共同检出的标记位点的比例不低于95%，从结果上进一步保证了不同实验间的检出的标记位点的抽样偏差控制在5%以内，保证了不同品种鉴定实验的结论的一致性。（七）本标准规定的MNP标记法的准确性本标准以及其它标准都

19、是以遗传相似系数作为品种鉴定的依据。因此，计算遗传相似系数的准确率，决定了品种鉴定的准确率。而遗传相似系数的计算又是根据品种间具有差异和相同基因型的标记位点的数目进行计算的。因此，品种鉴定的准确性最终取决于品种的基因型分型的准确性。由于真实值是未知的，因此，任何方法的绝对准确率是不可计算的。在实践中，要么将参考值假定为真实值计算准确率，要么利用精确度估计准确率。由于品种的标记位点的基因的参考值也是未知的，因此，我们利用三次重复性实验或者重现性实验来计算精确度，进而计算分型的准确率，准确率=1-（1-精确度）/2。其中，精确度是指两次实验的分型结果一致的标记位点占所有标记位点的比例，重复性实验指

20、由相同的人在相同的地点使用相同的试剂和仪器设备在短的间隔时间内做的两次实验，重现性实验指在3天以上的时间间隔条件下所做的两次独立实验。重现性实验模拟了不同批次的鉴定，重现率高意味着不同实验室的鉴定结果可以相互进行准确的比较。从表一可以看出，利用至少150,284个标记位点分型结果的统计表明，不论是重复性实验，还是重现性实验，不论是简单的二倍体物种水稻中，还是复杂的多倍体物种棉花中，MNP标记法分型的结果的准确率都在99.98%以上。本标准规定鉴定MNP标记位点不超过1100个（表二），那么，在一次鉴定中，错误的位点数量不超过1100*（1-99.98%）=0.41个，其对遗传相似系数的计算的变

21、异不超过0.0375%，对非平行实验即不同实验室的品种鉴定结果间比较的准确性的影响是很小的，基本可以忽略。由于本标准中的方法在重现性实验中的准确性超过99.98%，因此，可以在不同实验室不同时间中做出来的结果直接进行准确的比对，而不必在同一个实验室做平行实验，也不需要实验重复，对于品种鉴定提供了极大的方便。同时，可以将获得的等位基因型与DNA身份证数据库中的数据进行大量的比较，同样可以获得准确的鉴定结果，因此，极大地方便了近似品种的准确筛选、品种权侵权对象的准确确定、以及实质性派生品种的准确鉴定等应用。这些应用需要将一个品种的分型结果与成千上万个品种的分型结果进行比对，通过平行实验就需要做成千

22、上万次实验，不具有可行性，通过本标准的方法，只需要一次实验，然后把比对工作交给计算机处理即可，使得近似品种的准确筛选、品种权侵权对象的准确鉴定、以及实质性派生品种的准确鉴定等应用成为了可能。表一 水稻与棉花标记位点分型结果的重现性物种实验类别比较的标记位点的数目基因型不同的标记位点分型的精确率分型的准确率建库测序数目比例水稻重复性实验重复性实验 306,651 100.0033%99.997%99.998%相同文库重现性实验 155,231 100.0064%99.994%99.997%重现性实验重现性实验 306,528 350.0114%99.989%99.994%棉花重复性实验重复性实验

23、 295,975 680.0230%99.977%99.989%相同文库重现性实验 150,284 540.0359%99.964%99.982%重现性实验重现性实验 295,957 1110.0375%99.962%99.981%（八）本标准规定的MNP标记法的品种鉴定能力品种鉴定标准的核心任务是利用检测的标记位点对待测品种和对照品种进行区分。有两个重要因素影响了品种鉴定的核心任务，第一，单个标记的区分能力越强，该标记法区分品种的能力就越强；第二，使用的标记数目越多，该标记法的品种区分能力就越强。我们利用1500个水稻品种，比较了约300个随机选择的SSR标记和约300个随机选择的MNP标记

24、的等位基因型数量，其结果见图九。从图九可以看出，在1500个水稻品种中，SSR标记的等位基因型数量的平均值为5.5个，MNP标记的等位基因型的平均值为6.6个，MNP标记的等位基因型的数量比SSR标记高了1.1个，比例达到18.18%。在已有的分子标记类型中，SSR标记的多态性是最高的，显示了单个MNP标记位点具有极强的品种区分能力，同时也表明，MNP标记法的品种区分能力可以与SSR标记法的品种区分能力进行类比，因此，下面对于MNP标记法的标记位点数量的分析也是依据与SSR标记法进行类比而进行说明的。图九，1500个水稻品种中，平均等位基因型数量图九从理论上证明了MNP标记具有极高的多态性，因

25、此，从理论上讲MNP标记具有很强的品种区分能力。那么，实践中，MNP标记是否真的具有很强的品种区分能力呢？我们利用MNP标记法鉴定了多种物种的大量品种的DNA身份证，将每对品种间差异的MNP标记的比例称为品种间距离，品种间距离直接显示了MNP标记对品种的区分能力。图十至图十八显示利用MNP标记法鉴定的4000多万对品种间的比较结果，结果显示，MNP标记在不同作物的不同品种间具有很好的多态性。图十， 7,503对龙眼品种间距离分布图十一 17,956对番茄品种间距离分布图十二 29,883 对棉花品种间距离分布图十三，2,557对荔枝样品间距离分布图十四，621,056 对玉米品种间距离分布图十

26、五，3,730,438对水稻品种间距离分布图十六，5，672对艾草样品的距离分布图十七， 7，503对黄瓜样品间距离分布图十八， 3，733对黄瓜样品间距离分布表二列出了本标准范围中的16种植物的标记数目。从表二可以看出，本标准使用的标记数目最少也有500个，最多的有1042个，而现有的基于SSR标记法的标准中，最多的标准数目也不超过50个（见表三），从标记位点的数目上保障了本标准对品种区分能力的提高了12.03到23.38倍。值得一提的是，实质性派生品种的鉴定需要计算遗传相似系数，因此，使用的标记位点数目要足够才能准确计算遗传相似系数。已有的SSR标记法使用不超过50个标记位点（见表三），因

27、此，无法用于遗传相似系数和实质性派生品种的精准鉴定。UPOV用于实质性派生品种判定的SSR标记数量不超过400个，因此，本标准中使用的标记数量对于实质性派生品种的判定也是足够的。表二、MNP标记法与SSR标记法使用的标记位点的数量物种MNP标记法SSR标记法MNP标记法/SSR标记法水稻10334821.521玉米9354023.375大豆5073614.083蕃茄5794812.063棉花10423926.718西瓜7302826.071辣椒8322237.818黄瓜5323515.200大白菜5153017.167龙眼650/荔枝600/甜瓜734/辣椒832/艾草317/猕猴桃500/谷

28、子800/从以上分析可以看出，本标准中使用的MNP标记法不仅单个标记位点对品种的区分能力强，可以达到目前已知的品种区分能力最强的SSR标记的对品种的区分能力，而且标准中使用的标记数量也远大于SSR标记法的10倍以上。二者共同决定了MNP标记法具有极强的品种区分能力，再加上分型的高率准确性（表一），MNP标记法可以出色地完成植物品种鉴定任务。（九）品种鉴定的遗传相似度判定阈值1、实质性派生品种的判定阈值实质性派生品种和原始品种的目的是鼓励原始创新，判定阈值严格创新性越高但现有体系冲击更大，判定的阈值宽松虽然可以保持稳定但又不利于创新。因此，判定阈值需要根据特定植物种类的育种水平、标记方法等因素进

29、行综合平衡制定，需要在应用中社会广泛讨论后才能形成共识，因此，在本标准中，不宜直接规定该判定阈值的具体大小，等待未来在公众形成共识后再确定具体值。2、品种真实性的判定阈值种子法依据性状对新品种进行定义，即与已知品种间至少有一个性状的差异称为新品种。由于分子标记的差异与性状的差异之间的关系不是一一对应的关系，只能在一定概率保障下具有对应关系，即当分子标记差异较大时，高概率地保证至少有一个性状的差异，从而判定其为不同的品种。当分子标记差异较小时，有一定的概率保障为相同品种。然而，即使是差异为0个标记，也不能绝对保障两个品种间没有性状差异，因为分子标记是基因组上标记位点的抽样，可能还存在没有抽到的差

30、异标记位点。事实上，即使从哲学的角度看，不存在绝对相同的两个品种，性状鉴定也不能保证鉴定完所有的性状。基于以上理由，分子标记的判定阈值实际上就是一定概率保障的阈值，不是绝对意义上的相同品种与不同品种的划分界线，事实上，并没有一条可以完全区分相同与不同品种的阈值界线，因为二者的分布是部分重叠的。因此，遗传相似度的阈值划分是具有一定的主观性的，除了与性状的关联因素考虑外，还需要考虑多种因素进行综合平衡，再取一个相对能够接受的值。当植物在生产中广泛使用且选育周期不太长时，选育的品种的目的多样化且育成品种的数目比较多，品种特性需求也比较细致，不同品种之间的区分可能比较细微，因此，判定不同品种的阈值宜低

31、，此类植物主要包括大田和蔬菜作物。但作物不重要时或者选育周期很长时，育成品种数目不多，品种间区分度就比较大，可以适当地提高判定不同品种的阈值，此类作物主要为林木和中药材。表一列出了16个现行品种鉴定标准中，判定近似品种的阈值。其中，苹果为果树，育种周期长，判定的阈值为8.57%，较高。值得说明的是，我们同时采用SSR标记法和MNP标记法检测了1500个水稻品种，SSR标记与MNP标记的多态性大致相当，因此，SSR标记法的阈值可以作为MNP标记法阈值的参考值。但在参考SSR标记法的阈值时，应充分注意表一所有标准采用的SSR标记位点数目不足50个，因此，差异一个位点就变化2%以上的差异比例，抽样误

32、差较大，因此，表一中的阈值标准是考虑较多的技术误差或者位点的抽样误差的结果，而MNP标记法分型十分准确（表一），标记位点数量也很多（表二），这两类误差都已经充分避免，因此，表一中的阈值只能作为本标准阈值制定的参考值。表三，现行品种鉴定标准中，判定近似品种的阈值序号物种标准号标记法检测位点数判“近似品种”的差异位点的阈值位点比例1水稻NY/T 1433-2014SSR标记法4824.17%2水稻NY/T 3475-2015SNP标记法30721545%3玉米NY/T 1432-2014SSR标记法4025.00%4大豆NY/T 2595-2014SSR标记法3612.78%5蕃茄NY/T 247

33、1-2013Indel标记法4812.08%6棉花NY/T 2063-2014SSR标记法3925.13%7西瓜NY/T 2472-2013SSR标记法2827.14%8辣椒NY/T 2047-2013SSR标记法2229.09%9黄瓜NY/T 2474-2013SSR标记法3512.86%10大白菜NY/T 2476-2013SSR标记法3026.67%11小麦NY/T 2470-2013SSR标记法2129.52%12高粱NY/T 2467-2013SSR标记法4012.50%13甘蓝型油菜NY/T 2468-2013SSR标记法4748.51%14结球甘蓝NY/T 2473-2013SS

34、R标记法2015.00%15陆地棉NY/T 2469-2013SSR标记法3937.69%16苹果NY/T 2478-2013SSR标记法3538.57%在多个文献中，SNP标记都有1%以上的不可重现性，在杂交种中，可达到3%的不可重现性，而SSR标记的重现性更低。我们在不同实验室由不同人采用不同的试剂和仪器按本标准的方法，验证了大量标记位点的分型数据的重现性，分型重现性均大于99.98%（表一）。综合考虑植物特点和技术误差，本标准将区分水稻、玉米、大豆、棉花、花生、谷子、西瓜、甜瓜、黄瓜、番茄、辣椒、白菜的近似品种与不同品种的阈值确定为96%，将区分艾草、龙眼、荔枝、猕猴桃的近似品种与不同品

35、种的阈值确定为91%。育种家利用水稻品种三系保持系与不育系多代回交，培育保育系的不育系，因此，保持系与不育系之间的差异，代表了育种家通过回交能够达到的基因组间相似程度，这与育种家通过提纯复壮保持品种特性是类似的，因此，水稻品种的三系不育系与保持系之间遗传相似度可以作为判定“极近似品种或相同品种”的阈值。我们利用本标准的方法，检测了大约20对申请授权的不育系与保持系，它们之前的分子标记差异位点的比例最大为0.8%，因此，本标准中，将99%的遗传相似系数定为区分“近似品种”与“极近似品种或相同品种”的阈值。利用所确定的阈值，我们在700多个品种重现性实验中，将相同样品来源的样本均判定为了“极近似品

36、种或相同品种”，正确率100%。五、主要工作过程1、组成标准起草小组标准制定任务下达后，2017年1月，组成了标准起草工作组，明确了任务要求，安排了工作进度，会议研究讨论了标准制定的原则与方法，标准验证的方式与方法，标准中要研究的物种的类别与数量。2、开展相关调研情况品种鉴定的主要政策制定与应用单位为农业农村部科技发展中心等机构，2016年到农业农村部分科技发展中心及全国分中心参加调查4次以上，调研内容包括品种鉴定的政策与法规，应用需要等内容。3、标准起草完善过程依据GB/T 1.12000标准化工作导则第1部分：标准的结构和编写规则、GB/T 1.22002标准化工作导则第2部分：标准中规范

37、性技术要素内容的确定方法等标准编制要求，对植物品种鉴定MNP标记法标准开展了研制工作。起草工作小组完成了植物品种鉴定MNP标记法国家标准（草案）。2016年完成了标准的调研工作；2017年标准在国家标准委正式立项；2019年完成了标准的研制与验证工作。在此基础上，2019年3月征求了专家意见，起草组按照专家意见对标准内容进行了修改完善，形成了标准征求意见稿。六、方法验证及结果本标准的验证单位包括湖清华大学化学工程系、四川农业大学水稻研究所和郑州大学生命科学学院。三家单位根据标准中的方法分别对48个水稻品种、48个玉米品种和48个棉花品种的1000个标记位点进行了检测，获得每个品种的每个位点的分

38、型结果，将分型结果与江汉大学的分型结果进行比对，分型结果的重现率超过99.9%。三家位点使用的试剂耗材、仪器设备等与江汉大学不相同，说明本标准所列的方法在不同的实验室与实验条件下，结果具有高度可重现性，可以相互比对，十分有助于近似品种筛选、品种权侵权对象的鉴定、实质性派生品种的鉴定。七、与有关的现行法律、法规和强制性国家标准的关系本标准符合国家现行法律、法规、规章和强制性国家标准的要求，本标准有助于种子法等相关法律、法规、规章和强制性国家标准的实施。本标准的实施不涉及对现行标准的废止情况。八、标准属性的建议本标准属于检测方法标准，建议作为推荐性标准批准发布。九、贯彻国家标准的要求和措施建议标准发布后，加大标准宣贯和培训，更好地实施和应用标准。26