第五章╲t 高效毛细管电泳

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1、2022-7-3第第第第第第五五五五五五章章章章章章 高效毛细管电泳高效毛细管电泳高效毛细管电泳高效毛细管电泳高效毛细管电泳高效毛细管电泳第一节第一节 概述概述第二节第二节 理论基础理论基础第三节第三节 仪器组成仪器组成第四节第四节 分离模式分离模式第五节第五节 应用应用2022-7-3一、概述一、概述一、概述一、概述一、概述一、概述 在电解质溶液中，位于电场中的带电离子在电场力的作用下，以不同的速度向其所带电荷相反的电极方向迁移的现象，称之为电泳。由于不同离子所带电荷及性质的不同，迁移速率不同，可实现分离。1937年，Tiselius(瑞典)将蛋白质混合液放在两段缓冲溶液之间，两端施以电压进

2、行自由溶液电泳，第一次将人血清提取的蛋白质混合液分离出白蛋白和、球蛋白；发现发现样品的迁移速度和方向由其电荷和淌度决定；样品的迁移速度和方向由其电荷和淌度决定；第一次第一次的的自由溶液电泳；自由溶液电泳；第一台电泳仪第一台电泳仪；1948年，年，获诺贝尔化学奖获诺贝尔化学奖；（动画）（动画）2022-7-3二、经典电泳分析二、经典电泳分析二、经典电泳分析二、经典电泳分析二、经典电泳分析二、经典电泳分析 利用利用电泳电泳现象对某些化学或生物物质进行分离分析的方现象对某些化学或生物物质进行分离分析的方法和技术叫电泳法或电泳技术。法和技术叫电泳法或电泳技术。按形状分类：U型管电泳、柱状电泳、板电泳；

3、按载体分类：滤纸电泳、琼脂电泳、聚丙烯酰胺电泳、自由电泳；传统电泳分析：操作烦琐，分离效率低，定量困难，无法与其他分析相比。1981年，Jorgenson和Luckas，用75m内径石英毛细管进行电泳分析，柱效高达40万/m，促进电泳技术发生了根本变革，迅速发展成为可与GC、HPLC相媲美的崭新的分离分析技术高效毛细管电泳高效毛细管电泳。2022-7-3三、高效毛细管电泳三、高效毛细管电泳三、高效毛细管电泳三、高效毛细管电泳三、高效毛细管电泳三、高效毛细管电泳 High Performance Capillary ElectrophoresisHigh Performance Capillar

4、y ElectrophoresisHigh Performance Capillary ElectrophoresisHPCE HPCE 采取了两项重要改进：采取了两项重要改进：0.050.05mm mm 内径的石英毛细管；高达数千伏的电压内径的石英毛细管；高达数千伏的电压.毛细管的采用使产生的热量能够较快散发，大大减小了温度效 应，使电场电压可以很高。电压升高，电场推动力大，又可进一步使柱径变小，柱长增加，高效毛细管电泳的柱效远高于高效液相色谱，理论塔板数高达几 十万块/米，特殊柱子可以达到数百万。2022-7-3分离过程分离过程分离过程分离过程分离过程分离过程 电场作用下，毛细管柱中出现：

5、电泳现电泳现象和电渗流现象象和电渗流现象。带电粒子的带电粒子的迁移速度迁移速度=电泳电泳+电渗流；电渗流；两种速度的矢量和两种速度的矢量和。正离子正离子：两种效应的运动方向一致，在两种效应的运动方向一致，在负极最先流出负极最先流出；中性粒子中性粒子无电泳现象，受电渗流影响，无电泳现象，受电渗流影响，在阳离子后流出在阳离子后流出；阴离子阴离子：两种效应的运动方向相反两种效应的运动方向相反。电渗流 电泳时,阴离子在负极最后流出,在这种情况下,不但可以按类分离,除中性粒子外,同种类离子由于受到的电场力大小不一样也同时被相互分离。2022-7-3高效毛细管电泳的特点高效毛细管电泳的特点高效毛细管电泳的

6、特点高效毛细管电泳的特点高效毛细管电泳的特点高效毛细管电泳的特点1.1.仪器简单、易自动化仪器简单、易自动化 电源、毛细管、检测器、溶液瓶2.2.分析速度快、分离效率高分析速度快、分离效率高 在3.1min内分离36种无机及有机阴离子，4.1min内分离了24种阳离子；分离柱效：105107/m理论塔板数；3.3.操作方便、消耗少操作方便、消耗少 进样量极少，水介质中进行；4.4.应用范围极广应用范围极广 有机物、无机物、生物、中性分子；生物大分子等；分子生物学、医学、药学、化学、环境保护、材料等；2022-7-3 第二节第二节第二节高效毛细管电泳理论基础高效毛细管电泳理论基础高效毛细管电泳理

7、论基础2022-7-3 一、高效毛细管电泳一、高效毛细管电泳一、高效毛细管电泳(HPCE)HPCE)HPCE)基本原理基本原理基本原理 电泳是指带电离子在电场中的定向移动，不同离子具有电泳是指带电离子在电场中的定向移动，不同离子具有不同的迁移速度，不同的迁移速度，迁移速度与哪些因素有关？迁移速度与哪些因素有关？当带电离子以速度当带电离子以速度 在电场中移动时，受到大小相等、在电场中移动时，受到大小相等、方向相反的电场推动力和平动摩擦阻力的作用。方向相反的电场推动力和平动摩擦阻力的作用。电场力：电场力：FE=qE 阻阻 力：力：F=f故：故：qE=fq离子所带的有效电荷；E 电场强度；离子在电场

8、中的迁移速度；f 平动摩擦系数(对于球形离子：f=6；离子的表观液态动力学半径；介质的粘度；)2022-7-3所以，迁移速度：所以，迁移速度：EqfqE 6 （球形离子）物质离子在电场中物质离子在电场中差速迁移差速迁移是电泳分离的基础。是电泳分离的基础。淌度淌度：单位电场强度下的平均电泳速度。：单位电场强度下的平均电泳速度。6qE 2022-7-3二、电渗现象与电渗流二、电渗现象与电渗流二、电渗现象与电渗流 E E El l lectroosmosisectroosmosisectroosmosis and and and electroosmoticelectroosmoticelectro

9、osmotic flow flow flow1.1.电渗流现象电渗流现象 当固体与液体接触时，固体表面由于某种原因带一种电荷，则因静电引力使其周围液体带有相反电荷，在液-固界面形成双电层双电层，二者之间存在电位差。当液体两端施加电压时，当液体两端施加电压时，就会发生液体相对于固体表面就会发生液体相对于固体表面的移动，这种液体相对于固体的移动，这种液体相对于固体表面的移动的现象叫表面的移动的现象叫电渗现象电渗现象。电渗现象中整体移动着的电渗现象中整体移动着的液体叫液体叫电渗流电渗流（electroosmotic flow，简称简称EOF）。）。2022-7-32.2.2.HPCEHPCEHPCE

10、中的电渗现象与电渗流中的电渗现象与电渗流中的电渗现象与电渗流 石英毛细管柱，内充液石英毛细管柱，内充液pH3pH3时，表面电离成时，表面电离成-SiOSiO-,管管内壁带负电荷，形成双电层。内壁带负电荷，形成双电层。在高电场的作用下，带正电荷的溶液表面及扩散层向阴在高电场的作用下，带正电荷的溶液表面及扩散层向阴极移动，由于这些阳离子实际上是溶剂化的，故将引起柱中极移动，由于这些阳离子实际上是溶剂化的，故将引起柱中的溶液整体向负极移动，速度的溶液整体向负极移动，速度电渗流电渗流。2022-7-33.3.3.HPCEHPCEHPCE中电渗流的大小与方向中电渗流的大小与方向中电渗流的大小与方向 电渗

11、流的大小用电渗流速度电渗流的大小用电渗流速度电渗流电渗流表示，取决于电渗淌表示，取决于电渗淌度度和电场强度和电场强度E E。即即 电渗流电渗流=E E电渗淌度取决于电泳介质及双电层的电渗淌度取决于电泳介质及双电层的ZetaZeta电势，即电势，即 =0 00真空介电常数；介电常数；毛细管壁的Zeta电势。电渗流电渗流=0 0 E E实际电泳分析，可在实验测定相应参数后，按下式计算实际电泳分析，可在实验测定相应参数后，按下式计算 电渗流电渗流=L Lefef/t/teoeoLef 毛细管有效长度；teo电渗流标记物（中性物质）的迁移时间。2022-7-3HPCEHPCEHPCE中电渗流的方向中电

12、渗流的方向中电渗流的方向 电渗流的方向取决于毛细管内表面电荷的性质：电渗流的方向取决于毛细管内表面电荷的性质：内表面带负电荷，溶液带正电荷，电渗流流向阴极；内表面带负电荷，溶液带正电荷，电渗流流向阴极；内表面带正负电荷，溶液带负电荷，电渗流流向阳极；内表面带正负电荷，溶液带负电荷，电渗流流向阳极；石英毛细管；带负电荷，电渗流流向阴极；石英毛细管；带负电荷，电渗流流向阴极；改变电渗流方向的方法：改变电渗流方向的方法：（1 1）毛细管改性）毛细管改性 表面键合阳离子基团；（2 2）加电渗流反转剂）加电渗流反转剂 内充液中加入大量的阳离子表面活性剂，将使石英毛细管壁带正电荷，溶液表面带负电荷。电渗流

13、流向阳极。2022-7-34.4.4.HPCEHPCEHPCE中电渗流的流形中电渗流的流形中电渗流的流形 电荷均匀分布，整体移动，电渗流的流动为平流，塞式流动（谱带展宽很小）；液相色谱中的溶液流动为层流，抛物线流型，管壁处流速为零，管中心处的速度为平均速度的2倍（引起谱带展宽较大）。2022-7-35.5.5.HPCEHPCEHPCE中电渗流的作用中电渗流的作用中电渗流的作用 电渗流的速度约等于一般离子电泳速度的电渗流的速度约等于一般离子电泳速度的5 57 7倍；倍；各种电性离子在毛细管柱中的迁移速度为：各种电性离子在毛细管柱中的迁移速度为：+=电渗流电渗流+ef+ef 阳离子运动方向与电渗流

14、阳离子运动方向与电渗流一致一致；-=电渗流电渗流-ef-ef 阴离子运动方向与电渗流阴离子运动方向与电渗流相反相反；0 0=电渗流电渗流 中性粒子运动方向与电渗流一致；中性粒子运动方向与电渗流一致；（1 1）可一次完成阳离子、阴离子、中性粒子的分离；）可一次完成阳离子、阴离子、中性粒子的分离；（2 2）改变电渗流的大小和方向可改变分离效率和选择性，）改变电渗流的大小和方向可改变分离效率和选择性，如同改变如同改变LCLC中的流速；中的流速；（3 3）电渗流的微小变化影响结果的重现性；）电渗流的微小变化影响结果的重现性；在在HPCEHPCE中，控制电渗流非常重要中，控制电渗流非常重要。2022-7

15、-3三、三、三、HPCEHPCEHPCE中影响电渗流的因素中影响电渗流的因素中影响电渗流的因素1.1.电场强度的影响电场强度的影响 电渗流速度和电场强度成正比，当毛细管长度一定时，电渗流速度正比于工作电压。2.2.毛细管材料的影响毛细管材料的影响 不同材料毛细管的表面电荷特性不同，产生的电渗流大小不同；2022-7-33.3.3.电解质溶液性质的影响电解质溶液性质的影响电解质溶液性质的影响（1 1）溶液）溶液pHpH的影响的影响 对于石英毛细管，溶液pH增高时，表面电离多，电荷密度增加，管壁zeta电势增大，电渗流增大，pH=7pH=7，达到最大达到最大；pH3，完全被氢离子中和，表面电中性，

16、电渗流为零。分析时，采用缓冲溶液来保持pH稳定。（2 2）阴离子的影响）阴离子的影响 在其他条件相同，浓度相同而阴离子不同时，毛细管中的电流有较大差别，产生的焦耳热不同。缓冲溶液离子强度，影响双电层的厚度、溶液黏度和工作电流，明显影响电渗流大小。缓冲溶液离子强度增加，电渗流下降。2022-7-32022-7-34.4.4.温度的影响温度的影响温度的影响 毛细管内温度的升高，使溶液的黏度下降，电渗流增大。毛细管内温度的升高，使溶液的黏度下降，电渗流增大。温度变化来自于温度变化来自于“焦耳热焦耳热”；焦耳热：焦耳热：毛细管溶液中有电流通过时，产生的热量；毛细管溶液中有电流通过时，产生的热量；HPC

17、EHPCE中的焦耳热与背景电解质的摩尔电导、浓度及电场中的焦耳热与背景电解质的摩尔电导、浓度及电场强度成正比。强度成正比。温度每变化温度每变化1 1，将引起背景电解质溶液黏度变化，将引起背景电解质溶液黏度变化2%2%3%3%；2022-7-35.5.5.添加剂的影响添加剂的影响添加剂的影响（1）加入浓度较大的中性盐，如K2SO4，溶液离子强度增大，使溶液的黏度增大，电渗流减小。（2）加入表面活性剂，可改变电渗流的大小和方向；加入不同阳离子表面活性剂来控制电渗流。加入阴离子表面活性剂，如十二烷基硫酸钠（SDS），可以使壁表面负电荷增加，zeta电势增大，电渗流增大；（3）加入有机溶剂如甲醇、乙腈

18、，使电渗流增大。2022-7-3四、淌度四、淌度四、淌度 mobilitymobilitymobility 淌度淌度：带电离子在单位电场下的迁移速度；带电离子在单位电场下的迁移速度；淌度不同是电泳分离的基础。淌度不同是电泳分离的基础。1.1.绝对淌度绝对淌度(absolute mobility)ab 无限稀释溶液中带电离子在单位电场强度下的平均迁移速度，简称淌度。可在手册中查阅。2.2.有效淌度有效淌度(effective mobility)ef 实际溶液中的淌度(实验中测定的)。efef=a ai ii i ai 溶质i 的解离度；i 溶质i 在解离状态下的绝对淌度3.3.表观淌度表观淌度

19、ap 离子在实际分离过程中的迁移速度（表观迁移速度）：apap=ap ap E E2022-7-3五、五、五、HPCEHPCEHPCE中的参数与关系式中的参数与关系式中的参数与关系式1.1.迁移时间（保留时间）迁移时间（保留时间）HPCEHPCE兼具有电化学的特性和色谱分析的特性。有关色谱兼具有电化学的特性和色谱分析的特性。有关色谱理论也适用。理论也适用。VLLELLtapefapefapef V外加电压；L毛细管总长度；2.2.分离效率（塔板数）分离效率（塔板数）在在HPCEHPCE中，仅存在纵向扩散，中，仅存在纵向扩散，2 2=2=2DtDt22/154.5;22 YtnDELDLVLnR

20、efapefap 扩散系数小的溶质比扩散系数大的分离效率高，分离生扩散系数小的溶质比扩散系数大的分离效率高，分离生物大分子的依据。物大分子的依据。2022-7-33.3.3.分离度分离度分离度 DLVLRefap 平均平均 177.0 影响分离度的主要因素；工作电压影响分离度的主要因素；工作电压V V；毛细管有效长度毛细管有效长度与总长度比；有效淌度差。分离度可按谱图直接由下式计算：与总长度比；有效淌度差。分离度可按谱图直接由下式计算：221apap 平均平均1212)(2WWttR2022-7-3六、影响分离效率的因素六、影响分离效率的因素六、影响分离效率的因素区带展宽区带展宽区带展宽1.1

21、.纵向扩散的影响纵向扩散的影响 在在HPCEHPCE中，纵向扩散引起的峰展宽：中，纵向扩散引起的峰展宽：2 2=2=2DtDt 由扩散系数和迁移时间决定。大分子的扩散系数小，可由扩散系数和迁移时间决定。大分子的扩散系数小，可获得更高的分离效率，大分子生物试样分离的依据。获得更高的分离效率，大分子生物试样分离的依据。2.2.进样的影响进样的影响 当进样塞长度太大时，引起的峰展宽大于纵向扩散。分当进样塞长度太大时，引起的峰展宽大于纵向扩散。分离效率明显下降；理想情况下，进样塞长度离效率明显下降；理想情况下，进样塞长度：Winj=(24D t)1/2实际操作时进样塞长度小于或等于毛细管总长度的实际操

22、作时进样塞长度小于或等于毛细管总长度的1%1%2%2%。2022-7-33.3.3.焦耳热与温度梯度的影响焦耳热与温度梯度的影响焦耳热与温度梯度的影响 电泳过程产生的焦耳热可由下式计算：电泳过程产生的焦耳热可由下式计算：22EcLrIVQbm m电解质溶液的摩尔电导；I工作电流：cm电解质浓度；散热过程中，在毛细管内形成温度梯度（中心温度高），散热过程中，在毛细管内形成温度梯度（中心温度高），破坏了塞流，导致区带展宽。破坏了塞流，导致区带展宽。改善方法：改善方法：（1 1）减小毛细管内径；）减小毛细管内径；（2 2）控制散热；）控制散热；2022-7-34.4.4.溶质与管壁间的相互作用溶质与

23、管壁间的相互作用溶质与管壁间的相互作用 存在吸附与疏水作用，造成谱带展宽；存在吸附与疏水作用，造成谱带展宽；蛋白质、多肽带电荷数多，有较多的疏水基，吸附问题特别严重，是目前分离分析该类物质的一大难题难题。细内径毛细管柱，一方面有利于散热，另一方面比表面积大，又增加了溶质吸附的机会。减小吸附的方法和途径减小吸附的方法和途径：加入两性离子代替强电解质，两性离子一端带正电，另一端带负电，带正电一端与管壁负电中心作用，浓度约为溶质的100-1000倍时，抑制对蛋白质吸附，又不增加溶液电导，对电渗流影响不大。2022-7-35.5.5.其他影响因素其他影响因素其他影响因素 （1 1）电分散作用对谱带展宽

24、的影响）电分散作用对谱带展宽的影响 当溶质区带与缓冲溶液区带的电导不同时，也造成谱带展宽；尽量选择与试样淌度相匹配的背景电解质溶液。（2 2）“层流层流”现象对谱带展宽的影响现象对谱带展宽的影响 一般情况下，HPCE中不存在层流，但当毛细管两端存在压力差时，出现抛物线形的层流；产生的原因产生的原因：毛细管两端液面高度不同。实际操作时，保持毛细管两端缓冲溶液平面高度相同。2022-7-3第三节第三节第三节第三节第三节第三节高效毛细管电泳仪高效毛细管电泳仪高效毛细管电泳仪高效毛细管电泳仪高效毛细管电泳仪高效毛细管电泳仪2022-7-3一、高效毛细管电泳仪一、高效毛细管电泳仪一、高效毛细管电泳仪一、

25、高效毛细管电泳仪一、高效毛细管电泳仪一、高效毛细管电泳仪high performance capillary electrophoresis apparatushigh performance capillary electrophoresis apparatushigh performance capillary electrophoresis apparatus2022-7-3仪器仪器仪器仪器仪器仪器2 2 2 2 2 22022-7-3仪器仪器仪器仪器仪器仪器3 3 3 3 3 32022-7-3二、仪器流程与主要部件二、仪器流程与主要部件二、仪器流程与主要部件二、仪器流程与主要部件二、

26、仪器流程与主要部件二、仪器流程与主要部件 process and main assemblyprocess and main assemblyprocess and main assembly 电压：030kV；分离柱不涂敷任何固定液；紫外或激光诱导荧光检测器；（可检测到：10-1910-21 mol/L）2022-7-31.1.1.1.1.1.高压电源高压电源高压电源高压电源高压电源高压电源（1 1）0 03030 kV kV 稳定、连续可调的直流电源；稳定、连续可调的直流电源；（2 2）具有恒压、恒流、恒功率输出；）具有恒压、恒流、恒功率输出；（3 3）电场强度程序控制系统；）电场强度程序

27、控制系统；（4 4）电压稳定性：）电压稳定性：0.1%0.1%；（5 5）电源极性易转换；）电源极性易转换；2.2.毛细管柱毛细管柱（1 1）材料：石英：各项）材料：石英：各项性能好；玻璃：光学、机性能好；玻璃：光学、机械性能差；械性能差；（2 2）规格：内径）规格：内径20207575m m，外径外径350350400400m m；长度长度=1 电泳电泳时时,阴离子在阴离子在负极最后流出负极最后流出,在这种情况下在这种情况下,不但不但可以按类分离可以按类分离,同种类离子由于同种类离子由于差差速迁移速迁移被相互分离。被相互分离。最基本、应用广的分离模式；最基本、应用广的分离模式；2022-7-

28、3二、毛细管凝胶电泳二、毛细管凝胶电泳二、毛细管凝胶电泳 capillary gel electrophoresis capillary gel electrophoresis capillary gel electrophoresis，CGECGECGE 将聚丙烯酰胺等在毛细管柱内交联生成凝胶。将聚丙烯酰胺等在毛细管柱内交联生成凝胶。其具有多孔性，类似分子筛的作用，试样分子按大小分其具有多孔性，类似分子筛的作用，试样分子按大小分离。能够有效减小组分扩散，所得峰型尖锐，分离效率高。离。能够有效减小组分扩散，所得峰型尖锐，分离效率高。蛋白质、蛋白质、DNADNA等的电荷等的电荷/质量比与分子大小

29、无关，质量比与分子大小无关，CZECZE模模式很难分离，采用式很难分离，采用CGECGE能获得良好分离，能获得良好分离，DANDAN排序的重要手段。排序的重要手段。特点特点：抗对流性好，散热性好，分离度极高。：抗对流性好，散热性好，分离度极高。无胶筛分技术无胶筛分技术：采用低粘度的线性聚合物溶液代替高粘：采用低粘度的线性聚合物溶液代替高粘度交联聚丙烯酰胺。柱便宜、易制备。度交联聚丙烯酰胺。柱便宜、易制备。2022-7-3 1.1.缓冲溶液中加入离子型表面活性剂，其浓度达到临界缓冲溶液中加入离子型表面活性剂，其浓度达到临界浓度，形成一疏水内核、外部带负电的胶束。浓度，形成一疏水内核、外部带负电的

30、胶束。三、三、三、胶束电动毛细管色谱胶束电动毛细管色谱胶束电动毛细管色谱（MECC MECC MECC，MEKCMEKCMEKC）MicellarMicellarMicellar electrokineticelectrokineticelectrokinetic capillary chromatography capillary chromatography capillary chromatography，MEKCMEKCMEKC 在电场力的作在电场力的作用下，胶束在柱中用下，胶束在柱中移动。移动。2022-7-3 2.2.电泳流和电渗流的方向相反，且电泳流和电渗流的方向相反，且电渗流电

31、渗流 电泳电泳 ，负电胶束以较慢的速度向负极移动；负电胶束以较慢的速度向负极移动；5.5.色谱与电泳分离模式色谱与电泳分离模式的结合。的结合。3.3.中性分子在胶束相和溶液（水相）间分配，疏水性强中性分子在胶束相和溶液（水相）间分配，疏水性强的组分与胶束结合的较牢，流出时间长；的组分与胶束结合的较牢，流出时间长；4.4.可用来分离中性物质，扩展了高效毛细管电泳的应用可用来分离中性物质，扩展了高效毛细管电泳的应用范围范围；2022-7-3 1.1.根据等电点差别分离生物大分子的高分辨率电泳技术；根据等电点差别分离生物大分子的高分辨率电泳技术；2.2.毛细管内充有两性电解质（合成的具有不同等电点范

32、毛细管内充有两性电解质（合成的具有不同等电点范围的脂肪族多胺基多羧酸混合物），当施加直流电压（围的脂肪族多胺基多羧酸混合物），当施加直流电压（6 68 8V V）时，管内将建立一个由阳极到阴极逐步升高的时，管内将建立一个由阳极到阴极逐步升高的pHpH梯度；梯度；3.3.氨基酸、蛋白质、多肽等的所带电荷与溶液氨基酸、蛋白质、多肽等的所带电荷与溶液pHpH有关，有关，在酸性溶液中带正电荷，反之带负电荷。在其等电点时，呈在酸性溶液中带正电荷，反之带负电荷。在其等电点时，呈电中性，淌度为零；电中性，淌度为零；四、毛细管等电聚焦四、毛细管等电聚焦四、毛细管等电聚焦 capillary capillary

33、 capillary isoelectricisoelectricisoelectric focusing focusing focusing，CIEFCIEFCIEF2022-7-3 4.4.聚焦：具有不同等电点的生物试样在电场力的作用下聚焦：具有不同等电点的生物试样在电场力的作用下迁移，分别到达满足其等电点迁移，分别到达满足其等电点pHpH的位置时，呈电中性，停止的位置时，呈电中性，停止移动，形成窄溶质带而相互分离；移动，形成窄溶质带而相互分离；5.5.阳极端装稀磷酸溶液，阴极端装稀阳极端装稀磷酸溶液，阴极端装稀NaOHNaOH溶液；溶液；6.6.加压将毛细管内分离后的溶液推出经过检测器检

34、测；加压将毛细管内分离后的溶液推出经过检测器检测；7.7.电渗流在电渗流在CIEFCIEF中不利，应消除或减小。中不利，应消除或减小。2022-7-3 1.1.将两种淌度差别很大的缓冲液分别作为前导离子将两种淌度差别很大的缓冲液分别作为前导离子(充满充满毛细管毛细管)和尾随离子，试样离子的淌度全部位于两者之间，和尾随离子，试样离子的淌度全部位于两者之间，并以同一速度移动。并以同一速度移动。2.2.负离子分析时，前导电解质的淌度大于试样中所有负负离子分析时，前导电解质的淌度大于试样中所有负离子的。所有试样都按前导离子的速度等速向阳极前进，逐离子的。所有试样都按前导离子的速度等速向阳极前进，逐渐形

35、成各自独立的区带而分离。阴极进样，阳极检测。渐形成各自独立的区带而分离。阴极进样，阳极检测。五、毛细管等速电泳五、毛细管等速电泳五、毛细管等速电泳 capillary capillary capillary isotachophoresisisotachophoresisisotachophoresis ，CITPCITPCITP2022-7-3 3.3.不同离子的淌度不同，所形成区带的电场强度不同不同离子的淌度不同，所形成区带的电场强度不同(=EE)，淌度大的离子区带电场强度小；淌度大的离子区带电场强度小；沿出口到进口，将不同区带依次排序沿出口到进口，将不同区带依次排序1 1、2 2、3 3

36、、4 4 电场强度依次增大。假设电场强度依次增大。假设“2”“2”号中离子扩散到号中离子扩散到“3”“3”号，该号，该区电场强度大，离子被加速，返回到区电场强度大，离子被加速，返回到“2”“2”区；当区；当“2”“2”号中号中离子跑到离子跑到“1”“1”号区，离子被减速使之归队；号区，离子被减速使之归队；4.4.特点：界面明显，富集、浓缩作用；特点：界面明显，富集、浓缩作用；capillary capillary capillary isotachophoresisisotachophoresisisotachophoresis ，CITPCITPCITP2022-7-3亲亲和和毛毛细细管管电

37、电泳泳(affinity capillary electrophoresis，ACE)在在CZE缓缓冲冲液液或或CGE凝凝胶胶中中加加人人抗抗原原或或抗抗体体的的一一种种分分离离模模式式，它它对对研研究究和和分分析析抗抗原原与与抗抗体体的的相相互互作作用用有有重重要要应应用用价价值值，也也可可用用于于对对电电泳泳峰峰进进行行特特异异性性定定性性。对对应应的的电电泳泳条条件件与与CZE或或CCE相相似似。2022-7-3 六、毛细管电色谱六、毛细管电色谱六、毛细管电色谱（Capillary Electrochromatography)简称简称(CEC),是毛细管电泳和液相色谱的融合技是毛细管电泳

38、和液相色谱的融合技术，它的分离效率比液相色谱高；选择性术，它的分离效率比液相色谱高；选择性比毛细管电泳高。它是在毛细管中填充或比毛细管电泳高。它是在毛细管中填充或在毛细管壁涂层、键合色谱固定相，依靠在毛细管壁涂层、键合色谱固定相，依靠电渗流（电渗流（EOF）推动流动相，使样品分子推动流动相，使样品分子根据它们在色谱固定相和流动相之间吸附根据它们在色谱固定相和流动相之间吸附、分配平衡常数的不同和电泳速率不同而、分配平衡常数的不同和电泳速率不同而达到分离分析的一种电分离模式。达到分离分析的一种电分离模式。2022-7-3毛细管电泳和液相色谱相比，毛细管电泳和液相色谱相比，CEC的突出特点是的突出特

39、点是(1)分离效率比液相色谱高；分离效率比液相色谱高；(2)选择性比毛细管电泳高；选择性比毛细管电泳高；(3)分析速度快，分析结果重复性好；分析速度快，分析结果重复性好；(4)能实现样品的富集和预浓缩；能实现样品的富集和预浓缩；(5)流动相的使用量特小，有利于环保。流动相的使用量特小，有利于环保。2022-7-326种芳香化合物的分离种芳香化合物的分离2022-7-314种爆炸物的分离种爆炸物的分离2022-7-3第五节第五节第五节高效毛细管电泳应用与进展高效毛细管电泳应用与进展高效毛细管电泳应用与进展 一、离子分析一、离子分析 二、药物分析二、药物分析 三、手性化合物分析三、手性化合物分析

40、四、氨基酸分析四、氨基酸分析 五、五、核酸分析及核酸分析及DNADNA测序测序 六、新进展及热点问题六、新进展及热点问题2022-7-3毛细管电泳技术方法学的选择毛细管电泳技术方法学的选择离离子子 小小分分子子 肽肽类类 蛋蛋白白 核核酸酸 CZE MECC CZE CZE CGE ITP CZE MECC CGE MECC ITP IEF IEF CGE ITP ITP 2022-7-3一、离子分析一、离子分析一、离子分析阳离子分析阳离子分析 迁移方向和电渗流方向一致；4.5min内分离了24种金属离子；阳极进样，阴极检测；具有很高的灵敏度；2022-7-3阴离子分析阴离子分析阴离子分析 阴

41、离子电泳方向和电渗流方向相反、速度接近，分析时间长、效率低；质量小、电荷密度大的离子如：SO4-2、Cl-、F-等，电泳速率大于电渗流，阳极端流出，在阴极端无法检测；加入电渗流改性剂，十六烷基三甲基溴化胺等，使电泳方向和电渗流方向一致，可在3.1min内分离36种阴离子；阴极进样，阳极检测；离子价态及存在形态分析；2022-7-3二、药物分析二、药物分析二、药物分析 检测体液或细胞中某些代谢产物的分析；尿液中的氨基酸含量作为临床诊断糖尿病的辅助手段；采用毛细管区带电泳方式，在11min内分离17种药物；2022-7-3采用MEKC模式，鉴定违禁药物；效果优于HPLG法2022-7-3三、手性化

42、合物分析三、手性化合物分析三、手性化合物分析 合成获得单一手性化合物相当困难；528种手性合成药物，61中以单一对映体形式销售，其他为外消旋体；检测分析也相当困难；研究热点；R-反应停是安眠药，S-式致胎儿畸形；HPCE分离分析手性化合物的方法：加入手性选择剂；形成配合物的稳定常数有差异，结合HPCE的高效率；常用手性选择剂：环糊精及其衍生物；手性冠醚；手性表面活性剂（氨基酸衍生物、胆酸钠、牛磺脱氧胆酸及其钠盐、低聚糖等天然手性表面活性剂）2022-7-3四、氨基酸与蛋白质分析四、氨基酸与蛋白质分析四、氨基酸与蛋白质分析采用MEKC模式，在25分钟内分离了23种丹酰化氨基酸；HPCE可取代传统

43、的氨基酸分析仪；问题：吸附和检测；2022-7-3蛋白质分析蛋白质分析蛋白质分析2022-7-3五、核酸分析及五、核酸分析及五、核酸分析及DNADNADNA排序排序排序重要分析手段；图，酶解的双螺旋DNA限制性片段的分离；2022-7-3六、新进展六、新进展六、新进展1.1.微型化微型化 整体化学分析系统（TAS）及TAS微型化 在硅片上光刻出矩形槽作为毛细管，理论塔板数105/m；2.2.联用仪器联用仪器 CE-MS；3.3.阵列毛细管凝胶电泳阵列毛细管凝胶电泳 应用于人类基因DNA测序；510万个基因，30亿个碱基对，目前最有效的DNA序列分析仪，10小时/次；可同时电泳24个样品；速度1

44、200碱基对/小时，提高速度！100支毛细管阵列电泳；速度280碱基对/小时/支2022-7-3考试考试考试考试考试考试:2007年年5月月17日日 下午下午2:00-4:002022-7-32000级研究生现代分离技术与分析期终试题级研究生现代分离技术与分析期终试题（每题（每题10分）分）1 A.J.P.Martin 和和R.L.M.Synge 于于1952年获得了诺贝尔化学奖，年获得了诺贝尔化学奖，简述他们对色谱学的贡献。简述他们对色谱学的贡献。2 叙述色谱分离的基本原理，其定性定量的依据是什么？叙述色谱分离的基本原理，其定性定量的依据是什么？3 毛细管气相色谱与常规填充气相色谱有什么不同

45、？毛细管气相色谱与常规填充气相色谱有什么不同？4 液相色谱化学键合固定相有哪些优点？试举出一些，液相色谱化学键合固定相有哪些优点？试举出一些，正反相色谱的意义是什么？正反相色谱的意义是什么？5 写出色谱分离速率方程，叙述其物理意义。写出色谱分离速率方程，叙述其物理意义。6 叙述色谱学中容量因子的物理学意义。叙述色谱学中容量因子的物理学意义。7 毛细管电泳分离的实质是什么？它有哪些特点？有几种分类？毛细管电泳分离的实质是什么？它有哪些特点？有几种分类？8 毛细管电泳分离包括哪些实验条件？简述各种条件对分离的影响。毛细管电泳分离包括哪些实验条件？简述各种条件对分离的影响。9 某一分离组分在一定的条件下保留时间为某一分离组分在一定的条件下保留时间为10 min，峰宽为峰宽为24 s，不保不保 留时间为留时间为0.98 min,计算理论和有效柱效。计算理论和有效柱效。10性质相近两组分在一定的条件下其一保留时间为性质相近两组分在一定的条件下其一保留时间为10 min，峰宽为峰宽为24 s 假设要求分辨率不小于假设要求分辨率不小于2.0，另一组分的保留时间应为多少？，另一组分的保留时间应为多少？