分析化学教学课件：第十三章 紫外－可见分光光度法

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1、第第13章章紫外可见分光光度法紫外可见分光光度法Ultraviolet and Visible Spectrophotometry第第1313章章 紫外可见分光光度法紫外可见分光光度法（Ultraviolet and Visible Spectrophotometry）定义定义： 通常是指研究通常是指研究200-780nm光谱区光谱区域内，物质分子或离子对光辐射吸域内，物质分子或离子对光辐射吸收的一种方法，也称为收的一种方法，也称为吸光光度法吸光光度法或或分光光度法。分光光度法。 利用有色溶液对可见光的吸收利用有色溶液对可见光的吸收来进行定量测定，来进行定量测定， 称为称为比色法比色法。 第第

2、1313章章 紫外可见分光光度法紫外可见分光光度法（Ultraviolet and Visible Spectrophotometry）历史（历史（1）公元公元60年年 古希腊古希腊 普里尼普里尼 五倍子浸出液估测醋中五倍子浸出液估测醋中Fe十九世纪十九世纪30-40年代年代 比色是一种普遍分析方法比色是一种普遍分析方法 利用金属离子本身颜色或无机显色剂利用金属离子本身颜色或无机显色剂 MnO4- NH3 使使Cu2+ Co2+显色显色 方法：目视方法：目视比色法比色法 系列标样系列标样 Cs C2s C3s C4s C5s Cx 比较比较颜色深浅颜色深浅 第第1313章章 紫外可见分光光度法

3、紫外可见分光光度法（Ultraviolet and Visible Spectrophotometry）历史（历史（2）1852年年 Beer定律定律1868年年 布特列洛夫布特列洛夫 1870年年 杜包斯克杜包斯克 目视目视比色计比色计 浦氏光度计浦氏光度计1911年年 贝格尔贝格尔 硒硒光电池比色计光电池比色计1918年年 美国国家标准局美国国家标准局 第一台第一台分光光度计分光光度计20世纪世纪30-40年代年代 E.B.Sandell“痕迹金属比色痕迹金属比色测定测定” ” 20世纪世纪50年代年代 有机显色剂有机显色剂近二、三十年年 信息技术，高新技术，联用技术信息技术，高新技术，联

4、用技术第第1313章章 紫外可见分光光度法紫外可见分光光度法（Ultraviolet and Visible Spectrophotometry）13-1 选择吸收及吸收光谱的获得选择吸收及吸收光谱的获得 13-2 紫外可见吸收光谱的主要类型紫外可见吸收光谱的主要类型 13-3 光的吸收定律及定量分析方法光的吸收定律及定量分析方法 13-4 显色反应与光度测量显色反应与光度测量 13-5 吸光光度的其他分析技术吸光光度的其他分析技术 13-6 分光光度法在化学研究中的应用分光光度法在化学研究中的应用 第第1313章章 紫外可见分光光度法紫外可见分光光度法（Ultraviolet and Vis

5、ible Spectrophotometry）选择吸收及吸收光谱选择吸收及吸收光谱 光的吸收定律及定量分析光的吸收定律及定量分析方面方面光度分析的拓展及其应用光度分析的拓展及其应用 第第13章章 紫外可见分光光度法紫外可见分光光度法13-1 选择吸收及吸收光谱选择吸收及吸收光谱 1. 1. 选择吸收选择吸收宏观现象宏观现象 KMnO4 ( (紫红色紫红色) ) 吸收白光中的吸收白光中的 黄绿色黄绿色 CuSO4 ( (蓝色蓝色) ) 吸收白光中的吸收白光中的 黄色黄色 互补色互补色 结论结论同一种物质对不同波长的光表现出不同的吸同一种物质对不同波长的光表现出不同的吸收能力，称之谓选择吸收现象。

6、收能力，称之谓选择吸收现象。不同的物质对光的选择吸收性质是不同的。不同的物质对光的选择吸收性质是不同的。溶液的颜色并不是某一个波长，而是一个波溶液的颜色并不是某一个波长，而是一个波长带。长带。量子解释（量子解释（1）入射光的能量入射光的能量 能级间的能量差能级间的能量差 h h = hchc/ / = E E2 2- -E E1 1 = E E 普朗克条件普朗克条件 第第13章章 紫外可见分光光度法紫外可见分光光度法 13-1 选择吸收及吸收光谱选择吸收及吸收光谱 1. 1. 选择吸收选择吸收 E E ？一个分子的总能量一个分子的总能量 E E = =E E内能内能+ + E E平动能平动能+

7、 + E E电电+ + E E振振+ + E E转转 固有固有 连续变化连续变化 量子化量子化 E E = = E E电电+ + E E振振+ + E E转转量子解释（量子解释（2） E E = = E E电电+ + E E振振+ + E E转转110eV 0.051eV 10-40.05eV 10 101005eV 0.1eV 0.005eV n V 250nm 5nm 0.25nm J=1 V=1 n=1 J J=1 V=1 J=1 第第13章章 紫外可见分光光度法紫外可见分光光度法 13-1 选择吸收及吸收光谱选择吸收及吸收光谱 1. 1. 选择吸收选择吸收量子解释（量子解释（3）(1)

8、物质对光呈现选择吸收的原因物质对光呈现选择吸收的原因： 单一吸光物单一吸光物质的分子或离子只有有限数量的量子化能级质的分子或离子只有有限数量的量子化能级的缘故。的缘故。(2)选择吸收的性质选择吸收的性质：反映了分子内部结构的差反映了分子内部结构的差异，各物质分子能级千差万别，内部各能级异，各物质分子能级千差万别，内部各能级间的间隔也不相同。间的间隔也不相同。形成吸收带：形成吸收带：电子跃迁时不可避免要同时发电子跃迁时不可避免要同时发生振动能级和转动能级的跃迁。生振动能级和转动能级的跃迁。第第13章章 紫外可见分光光度法紫外可见分光光度法 13-1 选择吸收及吸收光谱选择吸收及吸收光谱 1. 1

9、. 选择吸收选择吸收透光度：透光度： T= I / I0 I0 I 吸光度：吸光度： A=lgT-1=lg(I0/I) 透射光谱：透射光谱： T 图图 吸收吸收光谱：光谱：A 图图 max Amax 吸收峰值波长吸收峰值波长 吸收峰值吸光度吸收峰值吸光度 吸收带宽吸收带宽 max （半峰宽）（半峰宽） 摩尔吸光系数摩尔吸光系数 物质的能量特征物质的能量特征 强度特征强度特征第第13章章 紫外可见分光光度法紫外可见分光光度法 13-1 选择吸收及吸收光谱选择吸收及吸收光谱 2. 2. 吸收吸收光谱光谱 KMnO4吸收吸收光谱：光谱： A - A - 图图 525n m 第第13章章 紫外可见分光

10、光度法紫外可见分光光度法 13-1 选择吸收及吸收光谱选择吸收及吸收光谱 2. 2. 吸收吸收光谱光谱 CaryCary分光光度计分光光度计第第13章章 紫外可见分光光度法紫外可见分光光度法 13-1 选择吸收及吸收光谱选择吸收及吸收光谱 3. 3. 吸收吸收光谱的获得光谱的获得 HPHP分光光度计分光光度计第第13章章 紫外可见分光光度法紫外可见分光光度法 13-1 选择吸收及吸收光谱选择吸收及吸收光谱 3. 3. 吸收吸收光谱的获得光谱的获得 紫外可见分光光度计基本结构有五部分组成紫外可见分光光度计基本结构有五部分组成主要类型有：主要类型有：手动型手动型1 1、单波长、单光束分光光度计、单

11、波长、单光束分光光度计 I I0 0 I I I I0 0 A A光源光源 单色光器单色光器 吸收池吸收池 检测器检测器 显示记录显示记录钨灯钨灯 滤光片滤光片 光电池光电池 电表电表卤钨灯卤钨灯 单色器单色器- - 光栅光栅 光电管光电管 记录仪记录仪氢灯或氘灯氢灯或氘灯 棱镜棱镜 光电倍增管光电倍增管 计算器系统计算器系统 第第13章章 紫外可见分光光度法紫外可见分光光度法 13-1 选择吸收及吸收光谱选择吸收及吸收光谱 3. 3. 吸收吸收光谱的获得光谱的获得 单色器后单束平行光，参比液和样品液轮流进入光路。单色器后单束平行光，参比液和样品液轮流进入光路。 常用于简易型的仪器。常用于简易

12、型的仪器。 适合定波长的吸光度测量，进行定量分析。适合定波长的吸光度测量，进行定量分析。扫描型扫描型2 2、单波长、单波长、双光束分光光度计双光束分光光度计 I I0 0 I I I I0 0 A A 第第13章章 紫外可见分光光度法紫外可见分光光度法 13-1 选择吸收及吸收光谱选择吸收及吸收光谱 3. 3. 吸收吸收光谱的获得光谱的获得单波长、单波长、双光束分光光度计双光束分光光度计 第第13章章 紫外可见分光光度法紫外可见分光光度法 13-1 选择吸收及吸收光谱选择吸收及吸收光谱 3. 3. 吸收吸收光谱的获得光谱的获得3 3、双双波长、波长、 双光束分双光束分 光光度计光光度计 A A

13、 第第13章章 紫外可见分光光度法紫外可见分光光度法 13-1 选择吸收及吸收光谱选择吸收及吸收光谱 3. 3. 吸收吸收光谱的获得光谱的获得阵列型阵列型4 4、全全波长波长光度计光度计 多多色仪色仪 检测器检测器 二极管阵列二极管阵列 CCD(Charge coupled device)CCD(Charge coupled device)第第13章章 紫外可见分光光度法紫外可见分光光度法 13-1 选择吸收及吸收光谱选择吸收及吸收光谱 3. 3. 吸收吸收光谱的获得光谱的获得第第13章章 紫外可见分光光度法紫外可见分光光度法 13-1 选择吸收及吸收光谱选择吸收及吸收光谱 3. 3. 吸收吸

14、收光谱的获得光谱的获得第第13章章 紫外可见分光光度法紫外可见分光光度法 13-1 选择吸收及吸收光谱选择吸收及吸收光谱 3. 3. 吸收吸收光谱的获得光谱的获得不同的物质对光有不同的选择吸收不同的物质对光有不同的选择吸收有何规律有何规律 max ， max 描述描述概念概念生色团生色团 助色团助色团 红移红移 ( (向红向红) ) max 蓝移蓝移 ( (向蓝向蓝) ) 浓色效应浓色效应( (增色效应增色效应) ) 浅色效应浅色效应( (减色效应减色效应) )强带强带 ( ( maxmax10104 4) )较强带较强带 (10 (104 4 maxmax 10103 3) ) max 弱带

15、弱带 ( ( maxmax 10 104例如：例如： h Fe3+CNS Fe2+CNS 第第13章章 紫外可见分光光度法紫外可见分光光度法 13-1 选择吸收及吸收光谱选择吸收及吸收光谱 4.4. 光谱类型光谱类型 类型类型 无机物中配位体场吸收带无机物中配位体场吸收带 maxmax=10=10-1-1-10-102 2 弱带弱带 maxmax 可见光区（可见光区（少量落在紫外及近红外光区）少量落在紫外及近红外光区） d-d 跃迁跃迁（吸收峰较宽）（吸收峰较宽） f-f 跃迁跃迁（吸收峰较窄）（吸收峰较窄） 过渡金属过渡金属 镧系和锕系元素镧系和锕系元素 3d，4d电子电子 4 f，5 f电

16、子电子 配合物的结构研究配合物的结构研究 ?1 ?2 第第13章章 紫外可见分光光度法紫外可见分光光度法 13-1 选择吸收及吸收光谱选择吸收及吸收光谱 4.4. 光谱类型光谱类型 类型类型 无机物中配位体场吸收带无机物中配位体场吸收带为什么在配位场作用下才可能发生为什么在配位场作用下才可能发生d -d ，f-f 跃迁呢？跃迁呢？ 过渡元素、镧系和锕系元素在真空下，原子、离子的过渡元素、镧系和锕系元素在真空下，原子、离子的d轨道轨道和和f轨道是简并的。轨道是简并的。 在配位体场影响下，简并能级发生分裂成不同能量组轨道。在配位体场影响下，简并能级发生分裂成不同能量组轨道。第第13章章 紫外可见分

17、光光度法紫外可见分光光度法 13-1 选择吸收及吸收光谱选择吸收及吸收光谱 4.4. 光谱类型光谱类型 类型类型 无机物中配位体场吸收带无机物中配位体场吸收带为什么为什么d-dd-d跃迁的吸收峰较宽，跃迁的吸收峰较宽，f-ff-f跃迁的吸收峰跃迁的吸收峰较窄呢？较窄呢？ 外层外层d电子跃迁时容易受外界环境（溶剂、配位体）电子跃迁时容易受外界环境（溶剂、配位体）的影响的影响 f电子在内层，受外层轨道电子的屏蔽，不易受溶电子在内层，受外层轨道电子的屏蔽，不易受溶剂、配位体影响剂、配位体影响 Ce58 1s2 2s2 2p6 3s2 3p6 3d10 4s2 4p6 4d10 4f 2 5s2 5p

18、6 6s2 Pr59 4f 3 Nd60 4f 4 Ho67 4f 11第第13章章 紫外可见分光光度法紫外可见分光光度法 13-1 选择吸收及吸收光谱选择吸收及吸收光谱 4.4. 光谱类型光谱类型小结小结 波数波数cm-1lg 100000 50000 33000 25100000 50000 33000 25000 20000 16667 14286 12500000 20000 16667 14286 12500 6 6 远远UV UV UV UV VisVis 5 5 * 共轭共轭 电荷转移电荷转移 4 * n 杂环杂环 * 3 n * 2 n * 共轭共轭 1 1 配位体场吸收带配位

19、体场吸收带 10 100 200 300 400 500 600 700 800nm1.吸收定律及吸收定律及影响因素影响因素BeerBeer定律定律 ( (Lambert-BeerLambert-Beer定律定律) ) A = a b c吸光度吸光度 改为改为 mol/L 时时A=lgT-1 吸光系数吸光系数 吸收光程吸收光程 浓度浓度 A = b c=lg(I0/I) (吸收池厚度吸收池厚度)无量纲无量纲 cm-1 (g/L)-1 cm g/L 摩尔吸光系数摩尔吸光系数 cm-1 (mol /L)-1 A.Beer, Ann.der Physik.Chemie, (3), 26, 78(18

20、52). 133第第13章章 紫外可见分光光度法紫外可见分光光度法 13-2 光的吸收定律及定量分析方面光的吸收定律及定量分析方面第第13章章 紫外可见分光光度法紫外可见分光光度法 13-2 光的吸收定律及定量分析方面光的吸收定律及定量分析方面 1. 吸收定律及影响因素 BeerBeer定律定律 入射入射 吸光质点行为相互无关吸光质点行为相互无关Lambert定律定律 Beer定律定律 -dIx=kxIxdx -dIc=kcIcdc -dIx/Ix=kx dx -dIc/Ic=kcIcdc积分，积分，I0Ix 0b I0 Ix 0 c ln(I0/I) = kx b ln(I0/I) = kc

21、 c A = lg(I0/I) = k1 b A = lg(I0/I) = k2c 合并合并 A = lg(I0/I) = a b c Lambert-Beer定律定律 简称简称Beer定律定律第第13章章 紫外可见分光光度法紫外可见分光光度法 13-2 光的吸收定律及定量分析方面光的吸收定律及定量分析方面 1.吸收定律及影响因素 BeerBeer定律定律 用量子观点推导用量子观点推导Beer定律定律 吸光质点总数吸光质点总数 n I0 IX I 吸光体的总截面积吸光体的总截面积 s dx b 分子的俘获截面分子的俘获截面 从统计学的观点看从统计学的观点看 dIx dn 光的俘获分数光的俘获分

22、数 = 俘获光子的几率俘获光子的几率 Ix s第第13章章 紫外可见分光光度法紫外可见分光光度法 13-2 光的吸收定律及定量分析方面光的吸收定律及定量分析方面 1.吸收定律及影响因素 BeerBeer定律定律( 用量子观点推导用量子观点推导Beer定律定律 )光束通过光束通过b厚度厚度 ，积分。，积分。 由由吸光度的定义：吸光度的定义： I0 n A = lg = I 2.303s ns = V / b A = 0.4343 NA b NA V dm3 Avogadro常数常数 cm 吸光质点的浓度吸光质点的浓度c（mol dm 3） A = 0.4343 6.023 1023 10 3 b

23、 c = 2.614 1020 b c A = b c 第第13章章 紫外可见分光光度法紫外可见分光光度法 13-2 光的吸收定律及定量分析方面光的吸收定律及定量分析方面 1.吸收定律及影响因素 BeerBeer定律定律 几点说明几点说明 推导推导BeerBeer定律的四点假定定律的四点假定 加和性加和性 A = b （ 1 c1 + 2 c2 + 3 c3+ + n cn） （1 1）n 种互不作用的吸光物质种互不作用的吸光物质 （2 2）同一波长）同一波长 = 2.614 1020 = (1/3) 统计常数统计常数 分子大小截面分子大小截面 跃迁几率跃迁几率 10-15cm2 (0.05

24、0.5) 可以估算得可以估算得 105 , 实际情况实际情况 在在 104103。 科学启示科学启示第第13章章 紫外可见分光光度法紫外可见分光光度法 13-2 光的吸收定律及定量分析方面光的吸收定律及定量分析方面 1. 吸收定律及影响因素 影响因素影响因素吸收定律的适应性及可靠性吸收定律的适应性及可靠性 物质物质 信号信号 A = b c 令令b=1cm A = c 能量能量 样品溶液因素样品溶液因素 基本限制基本限制 0.01 mol / L 浓度浓度分子或离子间距缩小分子或离子间距缩小电荷分布改变电荷分布改变吸收能力吸收能力 高浓度高浓度 n 改变改变 改变改变 溶剂影响溶剂影响 “ “

25、非真非真”吸收吸收 试剂，溶剂中的杂质试剂，溶剂中的杂质 影响因素影响因素吸收定律的适应性及可靠性吸收定律的适应性及可靠性 样品溶液因素样品溶液因素 溶液组分间的相互作用不可避免-即平衡影响-化学误差 ： 例一例一 CrCr2 2O O7 72-2-离子在水溶液中存在着二聚平衡离子在水溶液中存在着二聚平衡 Cr2O72-+H2O 2HCrO42- 2H+ + 2CrO42- 橙橙 黄黄 吸收绿蓝吸收绿蓝 光（光（450nm） 吸收蓝吸收蓝 光（光（375nm） A 比尔定律比尔定律 发生了正偏差发生了正偏差 0.033 0.050 0.100 c第第13章章 紫外可见分光光度法紫外可见分光光度

26、法 13-2 光的吸收定律及定量分析方面光的吸收定律及定量分析方面 1. 吸收定律及影响因素 影响因素影响因素吸收定律的适应性及可靠性吸收定律的适应性及可靠性 样品溶液因素样品溶液因素 溶液组分间的相互作用不可避免-即平衡影响-化学误差 例例: : FeFe3+ 3+ - - 水杨酸受水杨酸受 pH pH 影响影响pHpH 4 4 9 9 12 12 Fe(C Fe(C7 7H H4 4O O3 3) )+ + Fe(C Fe(C7 7H H4 4O O3 3) )2 2- - Fe(C Fe(C7 7H H4 4O O3 3) )3 33-3- Fe(OH) Fe(OH)3 3 紫色紫色 红

27、色红色 黄色黄色第第13章章 紫外可见分光光度法紫外可见分光光度法 13-2 光的吸收定律及定量分析方面光的吸收定律及定量分析方面 1. 吸收定律及影响因素第第13章章 紫外可见分光光度法紫外可见分光光度法 13-2 光的吸收定律及定量分析方面光的吸收定律及定量分析方面 1. 吸收定律及影响因素 影响因素影响因素吸收定律的适应性及可靠性吸收定律的适应性及可靠性 能量測量因素（仪器因素）能量測量因素（仪器因素） 仪器的单色光仪器的单色光 单色器提供的单色光单色器提供的单色光 0 0 是具有是具有一定的通带宽度，一定的通带宽度，( (即带宽）即带宽） 定量分析时取定量分析时取 为吸收峰宽为吸收峰宽

28、 的的1/81/10时，误差可不计时，误差可不计a.a.对对測量的測量的具体具体影响影响 0 0一定一定 A A A实实 - -A真真 = = A A为二次方为二次方影响影响 A实实A真真 ， A0不切实际不切实际 0 影响因素影响因素吸收定律的适应性及可靠性吸收定律的适应性及可靠性 能量測量因素（仪器因素）能量測量因素（仪器因素） 仪器的单色光仪器的单色光 A1a.a.对对測量的測量的具体具体影响影响 A2 一定一定不同不同 0， A不同不同 0101：峰峰 A1小小 A影响影响小小 02：陡坡：陡坡 A2大大 A影响影响大大 0， 一定一定 A 正比于正比于c 02 01 A 随随( A)

29、2变化，使变化，使A -c 曲线（向曲线（向c 弯曲）弯曲）第第13章章 紫外可见分光光度法紫外可见分光光度法 13-2 光的吸收定律及定量分析方面光的吸收定律及定量分析方面 1. 吸收定律及影响因素第第13章章 紫外可见分光光度法紫外可见分光光度法 13-2 光的吸收定律及定量分析方面光的吸收定律及定量分析方面 1. 吸收定律及影提供响因素 影响因素影响因素吸收定律的适应性及可靠性吸收定律的适应性及可靠性 能量測量因素（仪器因素）能量測量因素（仪器因素） 仪器的单色光仪器的单色光b b. .狭缝对提供单色光性能的关系狭缝对提供单色光性能的关系 I 1 0 2 1 0 2 1 0 2 入射狭缝

30、入射狭缝S S1 1出射狭缝出射狭缝S S2 2 S S1 1 =S=S2 2 S S1 1 S S2 2 单色光不纯单色光不纯 0 0 , ,I Imaxmax 光不纯光不纯 , ,I I 影响因素影响因素吸收定律的适应性及可靠性吸收定律的适应性及可靠性 能量測量因素（仪器因素）能量測量因素（仪器因素） 光光程问题程问题 光束倾斜光束倾斜 试样容器的窗面试样容器的窗面平行平行 n n n R A/A % 0.02mm 20 0.020 R 50 0.11 100 0.38 内反射损失内反射损失第第13章章 紫外可见分光光度法紫外可见分光光度法 13-2 光的吸收定律及定量分析方面光的吸收定律

31、及定量分析方面 1. 吸收定律及影提供响因素第第13章章 紫外可见分光光度法紫外可见分光光度法 13-2 光的吸收定律及定量分析方面光的吸收定律及定量分析方面 1. 吸收定律及影提供响因素 影响因素影响因素吸收定律的适应性及可靠性吸收定律的适应性及可靠性 能量測量因素（仪器因素）能量測量因素（仪器因素） 杂散光杂散光定义定义表示法：杂散光分数表示法：杂散光分数 S = Is / I0杂散光存在时的测量值杂散光存在时的测量值 1 I + Is 1+S 1+S A M =lg = lg =lg - = lg TM I0 + Is (I/I0)+S T +S几点说明：几点说明： 一台高质量的紫外可见

32、光光度计，杂散光应很小一台高质量的紫外可见光光度计，杂散光应很小 在仪器光谱感应区的极端，杂散光引起的误差较大在仪器光谱感应区的极端，杂散光引起的误差较大 高吸光度时，杂散光引起的相对误差大高吸光度时，杂散光引起的相对误差大第第13章章 紫外可见分光光度法紫外可见分光光度法 13-2 光的吸收定律及定量分析方面光的吸收定律及定量分析方面 1. 吸收定律及影提供响因素 影响因素影响因素吸收定律的适应性及可靠性吸收定律的适应性及可靠性 能量測量因素（仪器因素）能量測量因素（仪器因素） 光度误差光度误差 /c A = -lgT = a b c c/c = (0.4343 T)/(T lgT) T 与

33、与 T 的关系的关系 T = k1 a.暗电流，放大器噪声，暗电流，放大器噪声，0%T值的不精确性值的不精确性 b.热噪声热噪声 c.有限读出分辨率有限读出分辨率 T= k2(TT2)1/2 d.信号的散粒噪声信号的散粒噪声 T = k3 T e.e.光源的闪变噪声光源的闪变噪声 f.f.吸收池定位的不精确性吸收池定位的不精确性 第第13章章 紫外可见分光光度法紫外可见分光光度法 13-2 光的吸收定律及定量分析方面光的吸收定律及定量分析方面 1. 吸收定律及影提供响因素 影响因素影响因素吸收定律的适应性及可靠性吸收定律的适应性及可靠性 能量測量因素（仪器因素）能量測量因素（仪器因素） 光度误

34、差光度误差 /c 低中档仪器低中档仪器 c(有限读出分辨率有限读出分辨率)为主要因素为主要因素 T = k1 = 0.005 c/c = 1.5 - 3 % 0.003 c/c = 1 2 % 在在 10-80% T 即即 0.1-1.0 A）时时，误差小误差小第第13章章 紫外可见分光光度法紫外可见分光光度法 13-2 光的吸收定律及定量分析方面光的吸收定律及定量分析方面 1. 吸收定律及影提供响因素 影响因素影响因素吸收定律的适应性及可靠性吸收定律的适应性及可靠性 能量測量因素（仪器因素）能量測量因素（仪器因素） 光度误差光度误差 /c 高级分高级分光光度计光光度计 d. f.为主要因素为

35、主要因素 一般一般 k2 = = 0.003 0.003 误差小误差小 0.2 - 2.5 A k3 = = 0.003 0.003 A c/c 0 综合综合 k2， k3 一般一般在在 0.8 - 1.5 0.8 - 1.5 A c/c 小小 第第13章章 紫外可见分光光度法紫外可见分光光度法 13-2 光的吸收定律及定量分析方面光的吸收定律及定量分析方面 2. 定量分析方面 定量測定的溶液体系定量測定的溶液体系 在測量条件下，仅有在測量条件下，仅有单一物质单一物质有吸收有吸收被測物质本身有较大吸收，即被測物质本身有较大吸收，即 maxmax 大大 物质溶液体系物质溶液体系直接直接測量測量

36、A A被測物质本身吸收小，无被測物质本身吸收小，无 物质物质转化转化为有色物測量为有色物測量 A A 显色反应显色反应 显色剂显色剂-无机显色剂无机显色剂 有机显色剂（具有不饱和键基团）有机显色剂（具有不饱和键基团） N=N C=O C=S NO2 N=O 影响显色反应因素影响显色反应因素 络合物稳定性络合物稳定性, , 显色剂用量显色剂用量, , pH , , 温度温度, , 时间时间, , 溶剂溶剂第第13章章 紫外可见分光光度法紫外可见分光光度法 13-2 光的吸收定律及定量分析方面光的吸收定律及定量分析方面 2. 定量分析方面 定量測定的溶液体系定量測定的溶液体系 在測量条件下，仅有单

37、一物质有吸收在測量条件下，仅有单一物质有吸收 在測量条件下，体系内有在測量条件下，体系内有多种物质多种物质有吸收有吸收 物质分离各组分 第四篇第四篇 物质的化学掩蔽 滴定分析中有讨论滴定分析中有讨论 信息分离处理 见下面见下面13-313-3内容内容 定量測定的定量測定的光度光度測量測量波长波长 max 单色器宽度单色器宽度 单单 (1/81/10）吸吸 A 值值 落在落在 c/c 较较小区域小区域参比液参比液 消除除測定组分外引起吸收变化的影响消除除測定组分外引起吸收变化的影响溶剂溶剂 溶解能力溶解能力, ,吸收峰吸收峰, ,稳定性稳定性, ,对被測吸收峰的影响对被測吸收峰的影响 A=1=1

38、时，短波长端临界波长值（时，短波长端临界波长值（nm） 200 210 230 245 265 280 305 330200 210 230 245 265 280 305 330 水水 甲醇甲醇 甘油甘油 氯仿氯仿 四氯化碳四氯化碳 苯苯 吡啶吡啶 丙酮丙酮 正己烷正己烷 乙醇乙醇 二氯甲烷二氯甲烷 正庚烷正庚烷 异丙醇异丙醇 环己烷环己烷第第13章章 紫外可见分光光度法紫外可见分光光度法 13-2 光的吸收定律及定量分析方面光的吸收定律及定量分析方面 2. 定量分析方面第第13章章 紫外可见分光光度法紫外可见分光光度法 13-2 光的吸收定律及定量分析方面光的吸收定律及定量分析方面 2.

39、定量分析方面 定量校正方法定量校正方法 xi xi 编码编码 解码解码 间接法间接法 直接法直接法 用标准物校正用标准物校正 用确定的用确定的 y=f(x) 计算计算 定函数定函数 y=f(x) A = a 1%1cm, max c定量基本关系式定量基本关系式 A = bc = K c 标准标准吸光系数吸光系数 待定待定 绝对法绝对法 与实验条件有关与实验条件有关 （吸光系数法）（吸光系数法） 定量校正方法定量校正方法 单组份单组份測定測定 A = K c 外标法外标法 单个标样单个标样cs -直接比较法直接比较法-求求待定系数待定系数K-解析法解析法 （标准对照法）（标准对照法） cx=(A

40、x cs)/As 系列标样系列标样-标准标准曲线法曲线法-求求K 的平均的平均-图解法图解法 （工作（工作曲线法）曲线法） 作作As cs 图，图，求求K 由由图查图查Ax 的的c cx x 值值 解析法解析法 拟合拟合线性方程，线性方程，定定K 由由方程方程解解Ax 的的cx 值值 第第13章章 紫外可见分光光度法紫外可见分光光度法 13-2 光的吸收定律及定量分析方面光的吸收定律及定量分析方面 2. 定量分析方面 定量校正方法定量校正方法 单组份单组份測定測定 外标法外标法 注意点注意点： 标准样标准样cs 的确定的确定 单个标样时单个标样时cs 应与应与cx 值接近值接近 系列标样时系列

41、标样时cx 值应处于系列溶液浓度中间值应处于系列溶液浓度中间 用于简单试样体系用于简单试样体系 系列标样比单个标样更准确系列标样比单个标样更准确第第13章章 紫外可见分光光度法紫外可见分光光度法 13-2 光的吸收定律及定量分析方面光的吸收定律及定量分析方面 2. 定量分析方面 定量校正方法定量校正方法 单组份单组份測定測定 标准（标准（试样试样）加（减）入法）加（减）入法 增（减）量法增（减）量法 单个标样加入单个标样加入-标准加入标准加入法法 解析法解析法 （试样）（减） cx= (Vs cs/ V）Ax / （As+ x -Ax） 系列标样加入系列标样加入-系列标准加入系列标准加入法法-

42、图解法图解法 （连续标样加入） （连续标准加入法）作作A Vs 图，求图，求A=0 时时Vs 值值 由由 cx= -Vs cs/ V 计算计算 解析法解析法 拟合拟合线性方程，线性方程，由由方程方程解解A Ax x时的时的V Vs s 值值 由由 cx= Vs cs/ V 计算计算 第第13章章 紫外可见分光光度法紫外可见分光光度法 13-2 光的吸收定律及定量分析方面光的吸收定律及定量分析方面 2 . 定量分析方面 定量校正方法定量校正方法 单组份单组份測定測定 标准标准( (试样试样) )加加( (减减) )入法入法 增增( (减减) )量法量法 注意点注意点： 标准样标准样cs 的确定的

43、确定 加入标准样加入标准样cs cx 100，VsV/100 保持各測试溶液浓度在同一数量级，基体相似保持各測试溶液浓度在同一数量级，基体相似 用于复杂试样体系，或试样量少场合。用于复杂试样体系，或试样量少场合。 系列标样加入比单个标样加入更准确。系列标样加入比单个标样加入更准确。第第13章章 紫外可见分光光度法紫外可见分光光度法 13-2 光的吸收定律及定量分析方面光的吸收定律及定量分析方面 2.定量分析方面 定量校正方法定量校正方法 多组份体系多组份体系測定（信号重叠时）測定（信号重叠时） 加和性原则加和性原则 m 个波长处，建个波长处，建 m 个方程个方程 1 A1=A1a+A1b+ =

44、K1a ca+K1b cb+ a 2 A2=A2a+A2b+ =K2a ca+K2b cb+ b m Am =Ama+Amb+ =Kma ca+Kmb cb+ 1 2 m m n m n Aj = Aji = (Kji ci) j=1,2, m 波长点数波长点数 j=1 j=1 i=1 j=1 i=1 i=1,2, n 组份组份数（数（mn）第第13章章 紫外可见分光光度法紫外可见分光光度法 13-2 光的吸收定律及定量分析方面光的吸收定律及定量分析方面 2.定量分析方面 定量校正方法定量校正方法 多组份体系多组份体系測定測定( (信号重叠时）信号重叠时） 外标法外标法 单组单组 ( (n个组

45、份个组份) )混合标样混合标样 csi , , 測定測定Asj , 求求Kji （j=1,2, m ，i=1,2, n ） 測定測定Axj , 求求cxi 系列组系列组 ( (n个组份个组份) )混合标样混合标样 csi 组数组数 測定測定Asj 组数组数, 求平均求平均Kji （j=1,2, m ，i=1,2, n ） 測定測定Axj , 求求cxi 求解方程组：求解方程组： m = n 方法方法 m n 方法方法 标准加入法标准加入法? ?第第13章章 紫外可见分光光度法紫外可见分光光度法 13-2 光的吸收定律及定量分析方面光的吸收定律及定量分析方面 2. 定量分析方面1.1. 定量分析

46、中的两个重要摡念定量分析中的两个重要摡念 灵敏度灵敏度 一般定义一般定义 S=dY/dX 吸吸光度法中光度法中 S=dA/dc 或或 S= A/ c 当当 b=1 时，时， S = 桑德尔（桑德尔（SandellSandell）灵敏度灵敏度S 定义定义 一定波长，一定带宽，光程一定波长，一定带宽，光程1cm时，时， 测得吸光度为测得吸光度为0.001， 每毫升溶液所含吸光物质的微克数，单位每毫升溶液所含吸光物质的微克数，单位 g cm-2。 = F/S第第13章章 紫外可见分光光度法紫外可见分光光度法 13-3 光度分析的拓展及其应用光度分析的拓展及其应用 注意点注意点1 同一同一 值，不同元

47、素，因其值，不同元素，因其 F 值不同，值不同，S 不同。不同。2 经显色反应，组份变为吸光物质，使用经显色反应，组份变为吸光物质，使用S 时并不要求时并不要求知道吸光物质组成。知道吸光物质组成。3 一般元素一般元素 S 值为值为 0.001 0.01 g cm-2。4 最小检测浓度最小检测浓度 cmin= S / b = F / b ( g cm-3) 例：例：Fe2+-邻二氮菲邻二氮菲 F：55.85 : 1.1104 b:1 cm cmin= 0.0050 g cm-3 =110-7 mol/L5 使用灵敏度摡念时，要区分光度使用灵敏度摡念时，要区分光度(显色显色)反应灵敏度和反应灵敏度

48、和分析方法灵敏度，光度反应灵敏度是分析方法灵敏分析方法灵敏度，光度反应灵敏度是分析方法灵敏度的核心。度的核心。第第13章章 紫外可见分光光度法紫外可见分光光度法 13-3 光度分析的拓展及其应用光度分析的拓展及其应用1.1. 定量分析中的两个重要摡念定量分析中的两个重要摡念 灵敏度灵敏度 提高灵敏度的基本途径提高灵敏度的基本途径 试样试样 改善分子的光度特性改善分子的光度特性 更灵敏的显色试剂更灵敏的显色试剂 多元配合物或表面活性剂多元配合物或表面活性剂 利用化学反应利用化学反应 放大反应，转换为放大反应，转换为 大的物质大的物质 利用动态的化学动力学方法利用动态的化学动力学方法 仪器仪器 改

49、进測量技术改进測量技术 下降最小下降最小A 值值，下降散射光下降散射光 提高单色性，利用吸收窄峰提高单色性，利用吸收窄峰 加长吸光光程加长吸光光程第第13章章 紫外可见分光光度法紫外可见分光光度法 13-3 光度分析的拓展及其应用光度分析的拓展及其应用1.1. 定量分析中的两个重要摡念定量分析中的两个重要摡念 灵敏度灵敏度 选择性（干扰问题）选择性（干扰问题） 选择性试剂选择性试剂 特效试剂特效试剂 分离是消除干扰分离是消除干扰 提高分光光度法选择性的途径提高分光光度法选择性的途径 试样试样(1)(1)寻求高选择性的试剂，引入分析功能寻求高选择性的试剂，引入分析功能团团 (2) (2)用化学方

50、法改进溶液体系，掩蔽法用化学方法改进溶液体系，掩蔽法 仪器仪器(3)(3)采用新的测量技术，包括信息处理技术采用新的测量技术，包括信息处理技术第第13章章 紫外可见分光光度法紫外可见分光光度法 13-3 光度分析的拓展及其应用光度分析的拓展及其应用1.1. 定量分析中的两个重要摡念定量分析中的两个重要摡念 用于高浓度方向，用于高浓度方向，提高光度法提高光度法測量精密度（准确度）測量精密度（准确度） 光度滴定光度滴定法法光度滴定法的定量关系是建立在化学反应计量关系上光度滴定法的定量关系是建立在化学反应计量关系上 滴定过程中吸光度变化来指示滴定终点滴定过程中吸光度变化来指示滴定终点自学要点：自学要

51、点： （1）与一般的滴定分析法（目视定终点）比较）与一般的滴定分析法（目视定终点）比较 （2）与常规光度法比较）与常规光度法比较 （3）直接光度滴定法的滴定曲线形状）直接光度滴定法的滴定曲线形状 （4）间接光度滴定的滴定终点条件）间接光度滴定的滴定终点条件第第13章章 紫外可见分光光度法紫外可见分光光度法 13-3 光度分析的拓展及其应用光度分析的拓展及其应用2.2.光度滴定光度滴定法法及及示差分光光度法示差分光光度法 示差分光光度法示差分光光度法 提高測量精密度，測高含量提高測量精密度，測高含量 通过降低读数误差通过降低读数误差 办法是扩展标尺，充分利用仪器的灵敏度办法是扩展标尺，充分利用仪

52、器的灵敏度 測量上的差异測量上的差异 方法方法 调节调节Td=0% 调节调节Ts=100% 表观吸光度表观吸光度 Af G G 普通法普通法 关光闸关光闸 溶剂溶剂 Af=A= b cx A A 高高吸光度法吸光度法 关光闸关光闸 标准液标准液cs(cx) Af= b(cx cs) B B 低低吸光度法吸光度法 标准液标准液cd (cx) 溶剂溶剂 Afcx 非线性非线性 c 最精密法最精密法 标准液标准液cd (cx) 标准液标准液cs(cx) Afc 非线性非线性第第13章章 紫外可见分光光度法紫外可见分光光度法 13-3 光度分析的拓展及其应用光度分析的拓展及其应用2.2.光度滴定光度滴

53、定法法及及示差分光光度法示差分光光度法 示差分光光度法示差分光光度法 标尺扩展示意标尺扩展示意 A A C C B B 4%4%10% 40%10% 40%48%48% 60% 90% 60% 90%96%96%0%0%c cx xc cs s c cd d c cx x c cs s c cd d c cx x100%100% 光闸光闸 溶剂溶剂 T TG G普通法普通法 0% 0% 10 20 3010 20 30 48%48% 70 80 9070 80 90 100% 100% 40% 40% 60%60%第第13章章 紫外可见分光光度法紫外可见分光光度法 13-3 光度分析的拓展及其

54、应用光度分析的拓展及其应用2.2.光度滴定光度滴定法法及及示差分光光度法示差分光光度法 示差分光光度法示差分光光度法 表达式表达式 A A 高吸光度法高吸光度法 (Td=0)lgTf=Af= b(cx-cs) C C 最精密法最精密法 -lg(TfTs-TfTd+Td)= bcx B B 低吸光度法低吸光度法( (Ts=1) -lg(Tf-TfTd+Td)= bcx 表现透光度表现透光度普通法时标准液普通法时标准液 cs 的透光度的透光度 普通法时标准液普通法时标准液 cd 的透光度的透光度第第13章章 紫外可见分光光度法紫外可见分光光度法 13-3 光度分析的拓展及其应用光度分析的拓展及其应

55、用2.2.光度滴定光度滴定法法及及示差分光光度法示差分光光度法 示差分光光度法示差分光光度法示差法光度误差示差法光度误差 以使用较多的高吸光度法为例，导出其以使用较多的高吸光度法为例，导出其光度误差公式光度误差公式 cx 0.4343 Tf _ =_ cx Tf lg（Tf Ts ) （同一仪器中同一仪器中 Tf = T）思考思考：第第13章章 紫外可见分光光度法紫外可见分光光度法 13-3 光度分析的拓展及其应用光度分析的拓展及其应用2.2.光度滴定光度滴定法法及及示差分光光度法示差分光光度法 问题问题1:1: 绘制绘制（ cx/cx ）Tf 曲线（曲线（G.A.B.CG.A.B.C 四种方

56、法）四种方法） 已知：已知： T=0.005 , , A: Ts = 10 % B: Td = 90 % C: Ts = 55 % , Ts = 45 %问题问题2:2:如何证明如何证明 ( cx/cx )G ( cx/cx )示差示差 用数学方法，分离混合信号（信息分离）用数学方法，分离混合信号（信息分离） 多组份体系的光度分析的一般方多组份体系的光度分析的一般方法法 信号重叠 加和性原则 联立方程求解 经典方法经典方法 m=n 现代方法现代方法 mn参考：参考： (1) (1) 胡鑫尧、孙扬名、王心枢，计算机在分析化学中的应胡鑫尧、孙扬名、王心枢，计算机在分析化学中的应用，北京，清华大学出

57、版社，用，北京，清华大学出版社，19821982 (2) (2) 李克安、童沈阳，分析化学中的数值方法李克安、童沈阳，分析化学中的数值方法计算机计算机在分析化学中的应用，北京，北京大学出版社，在分析化学中的应用，北京，北京大学出版社，1990 1990 第第13章章 紫外可见分光光度法紫外可见分光光度法 13-3 光度分析的拓展及其应用光度分析的拓展及其应用3. 3. 双波长双波长分光光度法分光光度法及导数及导数光度法光度法 双波长双波长分光光度法分光光度法（19521952年提出，年提出，70-8070-80年代大发展）年代大发展） 等吸收点双波长方法等吸收点双波长方法 A A 1 1组份组

58、份1 1 A A1 1 A A1 1=A=A1 1 1 1- -A A1 1 2 2 = =（ 1 1 1 1- - 1 1 2 2）bcbc1 1 A A2 2= =0 0 2 2组份组份2 2 令令 A A2 2=A=A2 2 1 1- -A A2 2 2 2 = =（ 2 2 1 1- - 2 2 2 2）bcbc2 2 = 0= 0 组份组份1 1 , ,2 2混合混合 1 1 2 2 A A = A = A 1 1 - - A A 2 2 = = ( (A A1 1 1 1 + + A A2 2 1 1) )- -( (A A1 1 2 2 + + A A2 2 2 2) ) = (

59、A = (A1 1 1 1 - - A A1 1 2 2)+()+(A A2 2 1 1 - - A A2 2 2 2) ) 组份组份 2 2 作为干扰被消除作为干扰被消除 = = A A1 1 + + A A2 2 = = 0 0 = = kckc 定量分析基本关系式定量分析基本关系式第第13章章 紫外可见分光光度法紫外可见分光光度法 13-3 光度分析的拓展及其应用光度分析的拓展及其应用3. 3. 双波长双波长分光光度法分光光度法及导数及导数光度法光度法 双波长双波长分光光度法分光光度法 等吸收点双波长方法等吸收点双波长方法 本本方法关键：如何选择波长对方法关键：如何选择波长对 1 1，

60、2 2 。原则是：原则是：干扰组份干扰组份 A2=0 组份组份 A1 足够大足够大 避开避开 dA/d 大处大处 1 ， 2 尽可能接近尽可能接近第第13章章 紫外可见分光光度法紫外可见分光光度法 13-3 光度分析的拓展及其应用光度分析的拓展及其应用3. 3. 双波长双波长分光光度法分光光度法及导数及导数光度法光度法 提问提问1 1：如果要测组份如果要测组份2 2含量，应如何含量，应如何选择波长对选择波长对 1 1， 2 2？提问提问2 2：如果在干扰组份如果在干扰组份2 2的吸收光谱上找不到的吸收光谱上找不到等吸收点，等吸收点，怎么对怎么对组份组份1 1定量定量？第第13章章 紫外可见分光

61、光度法紫外可见分光光度法 13-3 光度分析的拓展及其应用光度分析的拓展及其应用3. 3. 双波长双波长分光光度法分光光度法及导数及导数光度法光度法 双波长双波长分光光度法分光光度法 等吸收点双波长方法等吸收点双波长方法 答答提问提问 2 系数倍率双波长方法系数倍率双波长方法 K组份组份1 A1=A1 1- A1 2 =（ 1 1- 1 2）bc1组份组份2 令令 A2=A2 1- A2 2 =（ 2 1- 2 2）bc2 = 0 组份组份1 ,2混合混合 A = A 1 - A 2 = (A1 1 + A2 1)- (A1 2 + A2 2) = (A1 1 - A1 2)+(A2 1 -

62、A2 2) 组份组份 2 作为干扰被消除作为干扰被消除 = A1 + A2 = 0 = kc 定量分析基本关系式定量分析基本关系式 双波长双波长分光光度法分光光度法 系数倍率双波长方法系数倍率双波长方法提问提问3 3：根据以上讨论根据以上讨论, ,你能设计一个双波长方法中选择你能设计一个双波长方法中选择波长对的计算机程序吗波长对的计算机程序吗? ?第第13章章 紫外可见分光光度法紫外可见分光光度法 13-3 光度分析的拓展及其应用光度分析的拓展及其应用3. 3. 双波长双波长分光光度法分光光度法及导数及导数光度法光度法 提问提问4 4：三三组份时，如何用组份时，如何用双波长方法消除二个双波长方

63、法消除二个组份的干组份的干扰？扰？提问提问5 5：双双组份时，用组份时，用三波长方法消除三波长方法消除组份干扰的原理？组份干扰的原理？提问提问6 6：双波长方法及三波长方法中双波长方法及三波长方法中, ,光度误差的表达式如光度误差的表达式如何何? ? 参考参考：王淑仁，徐广仁，买光昕，双波长分光光度法，济南，王淑仁，徐广仁，买光昕，双波长分光光度法，济南，山东科学技术出版社，山东科学技术出版社， 1986 1986 双波长双波长分光光度法分光光度法 系数倍率双波长方法系数倍率双波长方法例例: :测复方盐酸丙苯醇胺中的测复方盐酸丙苯醇胺中的扑尔敏扑尔敏 第第13章章 紫外可见分光光度法紫外可见分

64、光光度法 13-3 光度分析的拓展及其应用光度分析的拓展及其应用3. 3. 双波长双波长分光光度法分光光度法及导数及导数光度法光度法 pH=1, 水参比1=248.0 nm, 2=264.4 nm 1-盐酸丙苯醇胺(100g/ml)2-扑尔敏(16g/ml) 导数导数光度法光度法 （19531953年提出，年提出，8080年代起引人注目）年代起引人注目） 导数光谱的波形特征导数光谱的波形特征GaussGauss曲线表示光谱曲线表示光谱第第13章章 紫外可见分光光度法紫外可见分光光度法 13-3 光度分析的拓展及其应用光度分析的拓展及其应用3. 3. 双波长双波长分光光度法分光光度法及导数及导数

65、光度法光度法 导数导数光度法光度法 导数光谱的波形特征导数光谱的波形特征 三条规律性的现象三条规律性的现象（1 1）导数阶数导数阶数 n ，谱带极值数谱带极值数 ，并有，并有n+1个，峰个，峰形复杂化。形复杂化。（2 2） n 奇阶，峰值波长奇阶，峰值波长 0 ；(d nA/d n ) 0 =0 。 n 偶阶，峰值波长偶阶，峰值波长 0 ；(d nA/d n ) 0 为最大，负、为最大，负、正极值交替出现。正极值交替出现。（3 3）吸收光谱拐点吸收光谱拐点 1处处,(d nA/d n ) 0的情况与（的情况与（2）恰好相反。恰好相反。第第13章章 紫外可见分光光度法紫外可见分光光度法 13-3

66、 光度分析的拓展及其应用光度分析的拓展及其应用3. 3. 双波长双波长分光光度法分光光度法及导数及导数光度法光度法 导数导数光度法光度法 提高分辨率，灵敏度提高分辨率，灵敏度（1 1）识别效应：识别效应：辨认放大肩峰辨认放大肩峰 分辨重叠峰分辨重叠峰（相同峰值波长的宽谱带相同峰值波长的宽谱带与窄谱带重叠，用导数光谱法分离出窄峰。）与窄谱带重叠，用导数光谱法分离出窄峰。）第第13章章 紫外可见分光光度法紫外可见分光光度法 13-3 光度分析的拓展及其应用光度分析的拓展及其应用3. 3. 双波长双波长分光光度法分光光度法及导数及导数光度法光度法 导数导数光度法光度法 提高分辨率，灵敏度提高分辨率，灵敏度（2）消除背景干扰：）消除背景干扰：吸收光谱可用幂级数函数表达吸收光谱可用幂级数函数表达 A =C0+C1 + C2 2+C3 3+U 消失消失 A =C1+ 2C2 +3C3 2+U 消失消失 A = 2C2+6C3 +U 消失消失 第第13章章 紫外可见分光光度法紫外可见分光光度法 13-3 光度分析的拓展及其应用光度分析的拓展及其应用3. 3. 双波长双波长分光光度法分光光度法及导数及