酵母双杂交技术及其在蛋白质组课件

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1、酵母双杂交技术及其在蛋白质组酵母双杂交技术及其在蛋白质组研究中的应用.蛋白质组的概述.酵母双杂交系统.酵母双杂交在蛋白质组学中的应用酵母双杂交技术及其在蛋白质组（1）.产生背景 基因组研究自从开展以来已经取得了举世瞩目的成就。在过去几年中, 已经陆续完成了包括大肠杆菌、酿酒酵母等十多种结构比较简单的生物的基因组DNA的全序列分析。规模更为庞大的人类基因组计划在2005年完成全部基因组DNA的序列分析。但是也随之产生了新问题。 大量涌出的新基因数据迫使我们不得不考虑这些基因编码的蛋白质有什么功能这个问题。 不仅如此, 在细胞合成蛋白质之后, 这些蛋白质往往还要经历翻译后的加工修饰。 也就是说,

2、一个基因对应的不是一种蛋白质而可能是几种甚至是数十种。 包容了数千甚至数万种蛋白质的细胞是如何运转的？或者说这些蛋白质在细胞内是怎样工作、如何相互作用、相互协调的？这些问题远不是基因组研究所能回答得了的。 正是在此背景下, 蛋白质组学(proteomics)应运而生。 酵母双杂交技术及其在蛋白质组（2）蛋白组简介 蛋白质组蛋白质组(proteome)一词是马克.威尔金斯(Marc Wilkins)最先提出来的, 最早见诸于1995年7月“Electrophoresis”杂志上, 它是指一个有机体的全部蛋白质组成及其活动方式。 当前蛋白质组学的主要内容是, 在建立和发展蛋白质组研究的技术方法的同

3、时, 进行蛋白质组分析。 对蛋白质组的分析工作大致有两个方面： 一方面, 通过二维凝胶电泳得到正常生理条件下的机体、组织或细胞的全部蛋白质的图谱, 相关数据将作为待检测机体、组织或细胞的二维参考图谱和数据库。 一系列这样的二维参考图谱和数据库已经建立并且可通过联网检索。 二维参考图谱建立的意义在于为进一步的分析工作提供基础。 蛋白质组分析的另一方面, 是比较分析在变化了的生理条件下蛋白质所发生的变化。 如蛋白质表达量的变化, 翻译后修饰的变化, 或者可能的条件下分析蛋白质在亚细胞水平上的定位的改变等。 酵母双杂交技术及其在蛋白质组(3)蛋白质组学过程酵母双杂交技术及其在蛋白质组2.酵母双杂交系

4、统 2.1 双杂交系统的原理 2.2 Sos恢复系统 2.3 优点及局限酵母双杂交技术及其在蛋白质组2.1 双杂交系统原理 酵母双杂交技术是1989年由Fields等最先应的。与其他技术相比，它省去了耗时耗力的蛋白表达纯化以及抗体制备步骤，并且可以用于高通量的筛选，因此以其简便、快捷与廉价的优点迅速发展成为一种常用的研究蛋白质相互作用的方法。根据对文献的统计，目前已知的蛋白质相互作用至少有一半是通过酵母双杂交实验发现的。酵母双杂交技术及其在蛋白质组v酵母双杂交系统利用杂交基因通过激活报道基因的表达探测蛋白蛋白的相互作用。主要结构由含有DNA 结合域和DNA 转录激活域二类载体以及酵母报告株构成

5、。v 将DNA BD 与已知的诱饵蛋白质X 融合,构建出BD - X质粒载体;将AD 基因与cDNA 文库,基因片段或基因突变体(以Y表示) 融合,构建出AD- Y质粒载体。酵母双杂交技术及其在蛋白质组以以Fields等人建立的酵母杂交系统为例等人建立的酵母杂交系统为例vFields 等人的工作标志双杂交系统的正式建立。他们以与调控SUC2 基因有关的2 个蛋白质Snf1 和Snf2 为模型,将前者与GaL4 的DB 结构域融合,另外一个与Ga14 的AD 结构域的酸性区域融合。由DB和AD 形成的融合蛋白现在一般分别称之为“诱饵诱饵”(bait) 和“猎物猎物”或靶蛋白。如果在Snf1 和S

6、nf2 之间存在相互作用,那么分别位于这2个融合蛋白上的DB 和AD 就能重新形成有活性的转录激活因子,从而激活相应基因的转录与表达。这个被激活的、能显示“诱饵”和“猎物”相互作用的基因称之为报道基因报道基因(reporter gene) 。通过对报道基因表达产物的检测,反过来可判别作为“诱饵”和“猎物”的2 个蛋白质之间是否存在相互作用。在此基础上Fields 等人采用编码- 半乳糖苷酶的LacZ作为报道基因,并且在该基因的上游调控区引入受GaL4 蛋白调控的GAL1 序列。这个改造过的LacZ 基因被整合到酵母染色体URA3 位上。而酵母的GAL4 基因和GAL80 基因(GaL80 是G

7、aL4 的负调控因子) 被缺失,从而排除了细胞内源调控因子的影响。已经知道在Snf1 和Snf2 之间存在相互作用。结果发现只有同时转化了Snf1 和Snf2 融合表达载体的酵母细胞才有- 半乳糖苷酶活性,单独转化其中任何一个载体都不能检测出- 半乳糖苷酶活性。 酵母双杂交技术及其在蛋白质组酵母双杂交技术及其在蛋白质组酵母双杂交系统的实验基本过程酵母双杂交技术及其在蛋白质组Sos恢复系统v原理：v正常情况下，当有生长信号刺激的时候，酵母的Ras鸟苷酸交换因子Cdc25会富集到细胞膜上；这时Cdc25 能够促使Ras蛋白的GDP与GTP的交换，启动下游的信号，促进酵母细胞的生长。在酵母温度敏感缺

8、陷株CDC25-2中，Cdc25 由于突变丧失了上述功能，使得此菌株只能在25摄氏度下生长，而在限制温度37摄氏度无法生长。Sos 是哺乳动物细胞中的Ras 鸟苷酸交换因子，与酵母的Ras 鸟苷酸交换因子Cdc25 同源；研究发现人Sos 能够替代酵母Cdc25，使酵母细胞存活和增殖。于是在酵母温度敏感缺陷株Cdc25-2 中，当人的Sos 与膜定位信号（肉豆蔻酰化或法呢酯化信号）融合后，就会富集到细胞膜上，从而以不依赖配体的方式活化Ras 及生长信号，弥补Cdc25 的突变，使该菌株在37摄氏度可以生长。酵母双杂交技术及其在蛋白质组酵母双杂交技术及其在蛋白质组2.3 优点及局限v双杂交系统的

9、另一个构成部分是报道株。报道株指经改造的、含报道基因( repeetergene) 的重组质粒的细胞。目前，大多采用的是酵母细胞。其具有以下优点:酵母双杂交技术及其在蛋白质组v(1) 检测在真核活细胞内进行,在一定程度上代表细胞内的真实情况。酵母双杂交技术及其在蛋白质组v(2) 作用信号是在融合基因表达后,在细胞内重建转录因子的作用而给出的,省去了纯化蛋白质的繁琐步骤。酵母双杂交技术及其在蛋白质组v(3) 检测的结果可以是基因表达产物的积累效应,因而可检测存在于蛋白质之间的微弱的或暂时的相互作用。酵母双杂交技术及其在蛋白质组v(4) 酵母双杂交系统可采用不同组织、器官、细胞类型和分化时期材料构

10、建cDNA 文库,能分析细胞浆、细胞核及膜结合蛋白等多种不同亚细胞部位及功能的蛋白。酵母双杂交技术及其在蛋白质组v(5) 通过mRNA 产生多种稳定的酶使信号放大。同时,酵母表型,XGal 及HIS3 蛋白表达等检测方法均很敏感。酵母双杂交技术及其在蛋白质组 酵母双杂交系统在分析蛋白蛋白间相互作用具高效和快速性,但在实际应用方面仍存在一些局限性 。v(1) 双杂交系统分析蛋白间的相互作用定位于细胞核内,而许多蛋白间的相互作用依赖于翻译后加工如糖基化、二硫键形成等,这些反应在细胞核内无法进行。v(2) 酵母双杂交系统的一个重要的问题是“假阳性”。酵母双杂交技术及其在蛋白质组3.酵母双杂交在蛋白质

11、组学中的应用v随着 人 类 基因组计划的进行及各种模式生物基因组序列的产生，人们的研究重点也转移到对基因的产物 蛋白质的研究和分析上。蛋白质功能的研究着重在于蛋白质的细胞定位、蛋白质的时空表达模式和蛋白质与蛋白质间的相互作用.由于双杂交系统简便，敏感，高效的特点,使它非常适合基因组水平的大规模筛选。酵母双杂交技术及其在蛋白质组v 1、利用酵母双杂交发现新的蛋白质和蛋白质的新功能、利用酵母双杂交发现新的蛋白质和蛋白质的新功能v酵母双杂交技术已经成为发现新基因的主要途径。当我们将已知基因作为诱饵，在选定的cDNA文库中筛选与诱饵蛋白相互作用的蛋白，从筛选到的阳性酵母菌株中可以分离得到AD-LIBR

12、ARY载体，并从载体中进一步克隆得到随机插入的cDNA片段，并对该片段的编码序列在GENEBANK中进行比较，研究与已知基因在生物学功能上的联系。另外，也可作为研究已知基因的新功能或多个筛选到的已知基因之间功能相关的主要方法。 酵母双杂交技术及其在蛋白质组v2、利用酵母双杂交在细胞体内研究抗原和抗体的相互作用、利用酵母双杂交在细胞体内研究抗原和抗体的相互作用v利用酶联免疫（ELISA）、免疫共沉淀（CO-IP）技术都是利用抗原和抗体间的免疫反应，可以研究抗原和抗体之间的相互作用，但是，它们都是基于体外非细胞的环境中研究蛋白质与蛋白质的相互作用。而在细胞体内的抗原和抗体的聚积反应则可以通过酵母双

13、杂交进行检测。 酵母双杂交技术及其在蛋白质组v3、利用酵母双杂交筛选药物的作用位点以及药物对蛋白质、利用酵母双杂交筛选药物的作用位点以及药物对蛋白质之间相互作用的影响之间相互作用的影响v酵母双杂交的报告基因能否表达在于诱饵蛋白与靶蛋白之间的相互作用。对于能够引发疾病反应的蛋白互作可以采取药物干扰的方法，阻止它们的相互作用以达到治疗疾病的目的。 酵母双杂交技术及其在蛋白质组v4、利用酵母双杂交建立、利用酵母双杂交建立基因组基因组蛋白连锁图（蛋白连锁图（Genome Protein Linkage Map）v众多的蛋白质之间在许多重要的生命活动中都是彼此协调和控制的。基因组中的编码蛋白质的基因之间存在着功能上的联系。通过基因组的测序和序列分析发现了很多新的基因和EST序列，HUA等人利用酵母双杂交技术，将所有已知基因和EST序列为诱饵，在表达文库中筛选与诱饵相互作用的蛋白，从而找到基因之间的联系，建立基因组蛋白连锁图。 酵母双杂交技术及其在蛋白质组