植物组织培养实验报告

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1、院(系、部) 化学与生物工程学院 专业 生物技术（师范） 年级13级 学号17130208 姓名 组别 第二组 课程名称 植物细胞工程学 实验日期 2016.3-6 指导老师 实验名称 植物组织培养综合实验 一、 实验目的1. 熟悉MS培养基的组成，掌握贮备液的配制方法2. 学习、掌握植物组织固体培养基的配制和灭菌方法；3. 掌握超净工作台上的接种方法与注意事项，了解接种室的灭菌方法；4. 了解组织培养的基本程序；5. 掌握接种的方法和材料的培养过程；6. 掌握无菌操作技术，包括外植体除菌和接种技术；7. 观察外植体的生长状况、染菌状况，剔除染菌外植体；8. 了解MS培养基和1/2MS培养基的

2、区别二、 实验原理1. 植物细胞的全能性一切植物都由细胞构成，细胞是构成植物体的基本结构与功能单位。植物细胞含有全套遗传信息，具有形成完整植物的潜能。2. 植物细胞表现出全能性的条件1. 离体状态；2. 有一定的营养物质，激素和其他外界条件（无菌、温度、pH）；3. 选择性能优良、细胞全能性表达充分的基因型3. 无菌条件把植物的组织、器官等，使其在人工控制的无菌条件下，使植物在人工培养基上繁殖。用于进行组织培养的组织、器官和细胞称为外植体。在组培中外植体都死带菌的，在接种前必须进行表面消毒，这时取得培养成功的最基本和重要的前体。组织培养的主要过程都是在无菌条件下进行的，所以所有的器材、植物体、

3、接种室都应是无菌的。4. 脱分化与愈伤组织已有特定结构与功能的植物组织，在一定条件下，其细胞被诱导改变原来的发育途径，逐步逆转其原有的分化形态，转变为具有分生能力的胚细胞的过程称为脱分化。脱分化所用的化学物质与MS培养基的区别是需要激素诱导。所以脱分化培养需在MS培养基上添加激素进行愈伤组织诱导。5. 培养基植物组织培养常用的培养基为MS培养基。常用的凝固剂是琼脂,它的主要作用是使液体培养基凝固，琼脂本身并不提供任何营养，它只是一种高分予的碳水物从海藻中提取出来，仅溶解于热水，成为溶胶，冷却后(40以下)即凝固为固体状凝胶。琼脂的用量一般在410克升之间。琼脂的凝固能力除与原料、厂家的加工方式

4、等有关外，还与高压灭菌时的温度、时间、pH值等因素有关，长时间的高温会使凝固能力下降，过酸过碱加之高温会使琼脂发生水解而丧失凝固能力，存放时间过久，琼脂变褐，也会逐失去凝固能力。MS培养基属于富盐平衡培养基，特点是：无机盐浓度较高，元素间的比例适当，离子平衡性好，具有较强的缓冲性，因而在培养的过程中可维持较好的稳定性；营养丰富，在一般培养中无须额外加入复杂的有机成分；微量元素种类全，浓度高。这类培养基是目前使用最广泛的培养基。6. 生长调节物质包括天然植物激素额人工激素类似物。植物激素是一类植物自身合成、同时对其生长发育具有重要调节作用的有机化合物。生长调节物质对于离题培养中的细胞分裂分化、器

5、官形成和个体再生等均起着重要而明显的调节作用。一般来说，基本培养基只能保证培养物的生存，维持其最低的生理活动，而只有植物激素的配合使用，才能完成离体培养物中按照需要设计的各个调节环节。常用的植物组培激素种类主要有生长素类、细胞分裂素类、赤霉素。1) 生长素的生理作用主要是促进细胞分裂和生长，有利于外植体脱分化并启动细胞分裂，有利于形成愈伤组织。同时生长素和细胞分裂素的协调作用，对于培养物的形态建立十分必要。在离体培养的分化调节中，生长素促进不定根的形成而抑制不定芽的发生。在液体培养中，生长素还有利于体细胞胚胎发生。常用的生长素有吲哚乙酸（IAA）、奈乙酸（NAA）、二氯苯氧乙酸（2，4-D）和

6、吲哚丁酸（IBA）等。在使用2，4-D时，必须严格控制使用浓度和培养时期，因为高浓度的2，4-D常常抑制器官的发生，在分化培养时不能使用2，4-D代替其他生长素。2) 细胞分裂素的主要作用是促进细胞的分裂，调节器官分化，延迟组织衰老，增强蛋白质合成等。此外，它还能显著改善其他激素。离体培养中，细胞分裂素能够促进不定芽的发生，与生长素协调使用能有效调控培养物的生长与分化。常用的细胞分裂素包括6-卞基嘌呤（6-BA）、激动素（KT）、异戊烯氨基嘌呤（2ip）、玉米素（ZT）等。3) 赤霉素（GA）是一类广泛存在于植物体内的激素，目前已发现的天然赤霉素有20多种。自然界植物体内的赤霉素具有促进细胞伸

7、长生长、诱导花芽形成、打破种子休眠及诱导单性结实等生理功能。在离体培养条件下，赤霉素的主要作用时促进细胞伸长生长，与生长素协同作用对形成层的分化具有一定影响，同时还能刺激体细胞胚进一步发育成植株。三、 实验材料、试剂和仪器设备1. 植物材料：马齿苋、番茄种子诱导的无菌苗、外植体（盘龙参、波斯菊、金叶女贞、黄花苜蓿、菊花、香樟、杜鹃、月季）2. 实验药品（试剂）：甲醛、MS培养基母液（见表1）、蔗糖、琼脂、1%升汞、酒精（75%和90%）、NaOH、HCl、6-BA、NNA、无菌水；3. 仪器设备和实验用具：高压灭菌锅、天平、pH计、超净工作台、电炉、酒精灯、镊子、解剖刀、剪刀、烧杯、培养瓶、量

8、筒、烧杯、玻璃棒、广口试剂瓶、牛皮纸、滤纸、培养皿、药勺、支架、打火机等。四、 实验步骤(一) 培养基母液的配制(2016/3/4)1. MS培养基贮备液配制贮备液I(g)(20)贮备液III(mg) (100)MgSO47H2O3.70500mLFeSO47H2O 278 100mLNH4NO316.50Na2EDTA2H2O 373 CaCl22H2O4.40生长调节剂KNO319.006-BA50mg50mLKH2PO41.70NAA50mg贮备液II(mg) )(100)贮备液IV(mg) )(100)KI 8.3 100mL肌醇 1000 100mLH3BO3 62 烟酸 5 MnS

9、O44H2O 223 盐酸硫胺素 1 ZnSO47H2O 86 盐酸吡哆醇 5 Na2MoO42H2O 2.5 甘氨酸 20CuSO45H2O 0. 25 称量 溶解 混合 定容CoCl26H2O 0. 25 表11) 每种母液中的几种成分称量完毕后，分别用少量的蒸馏水彻底溶解，然后再将它们混溶，定容。2) 贮备液III需加热溶解。混合后调至pH5.5，定容，保存在棕色玻璃瓶内。3) 6-BA：1 mg/mL(溶于少量1N盐酸后以蒸馏水定容）。NAA：1 mg/mL（先用少量95%乙醇溶解后以蒸馏水定容）。4) 各种母液配制完成后，分别用玻璃瓶贮存，贴上标签，注明母液号、配制倍数、日期等，放入

10、冰箱冷藏室保存。一般无机物质的母液在冰箱中可保存半年以上，有机物质的母液保存时间在半年以内，但若发现有沉淀或霉变,应立即需重新配制。2. 其他试剂的配置1) 1 mol/L 的NaOH：1瓶2) 1 mol/LHCL ：1瓶3) 0.1%的升汞或2%次氯酸钠：每个超净工作台一瓶（用时处理5-30min)4) 7075%酒精：每个超净工作台一瓶5) 95%酒精：每个超净工作台一瓶6) 75%酒精棉球：每个超净工作台一瓶(二) 培养基的配制与灭菌1. 培养基配制1) 配制培养液（MS培养液）：按每次配制500 mL培养基计，用量筒或者移液管从各种母液中分别取出贮备液I 25 mL、贮备液II、各5

11、 mL；2) 溶化琼脂：用粗天平分别称取5g琼脂、15g蔗糖放入500 mL搪瓷缸中，加入蒸馏水400 mL，用用电炉加热，边加热边用玻璃棒搅拌，直到液体呈半透明状。然后再将配好的混合培养液加入到煮沸的琼脂中，最后加蒸馏水定容至500 mL，搅拌均匀。3) 调pH：用滴管吸取物质的量浓度为1 mol/L的NaOH溶液，逐滴滴入溶化的培养基中，边滴边搅拌，并随时用精密的pH试纸（5.47.0）测培养基的pH，一直到培养基的pH为5.8为止（培养基的pH必须严格控制在5.8）。4) 培养基的分装 溶化的培养基应该趁热分装。分装时，先将培养基倒入烧杯中，然后将烧杯中的培养基倒入组培瓶（50 mL或1

12、00 mL）中。注意不要让培养基沾到瓶口和瓶壁上。组培瓶中培养基的量约50 mL 。每500 mL培养基，可分装1015瓶。5) 培养基分装完毕后，应及时封盖瓶口。最后在组培瓶外壁贴上标签。2. 培养基灭菌（高压灭菌）1) 放培养瓶。将装有培养基的培养瓶直立于金属小筐中，再放入高压蒸气灭菌锅内。如果没有金属小筐，可以在两层锥形瓶之间放一块玻璃板隔开。2) 放置其他需要灭菌的物品。将其他需要灭菌的物品也放入高压蒸气灭菌锅内，如装有蒸馏水的锥形瓶、带螺口盖的玻璃瓶、烧杯、广口瓶（以上物品都要用牛皮纸封口），用牛皮纸包裹的培养皿、剪刀、解剖刀、镊子、滤纸、铅笔等。3) 待需要灭菌的物品码放完毕，盖上

13、锅盖。在98 kPa、121.3 下，灭菌20 min。灭菌后取出培养瓶，让其中的培养基自然冷却凝固。最好放置1 d后再使用。3. 其他灭菌1) 不耐热的物质将采用过滤灭菌 如赤霉素、玉米素、脱落酸、尿素和某些维生素等。 过滤灭菌的原理：溶液通过滤膜后，细菌的细胞和孢子等因大于滤膜孔径而被阻。2) 玻璃器皿及耐热用具等可采用干热灭菌 即利用烘箱加热到160-180 的温度来杀灭微生物。3) 用于无菌操作的器械采用灼烧灭菌(三) 接种室和超净工作台的灭菌处理1. 接种室熏蒸灭菌长期不用的培养室或接种室要进行熏蒸。方法：甲醛、高锰酸钾熏蒸。甲醛的用量通常按每立方米空间2-6毫升计算，高锰酸钾的用量

14、是甲醛的一半。室内准备妥当后，把称好的高锰酸钾放在瓷碗或烧杯内(最好在碗或杯下面铺一张报纸，以利清洗)，然后将甲醛也倒入碗或杯内，立即出屋关门。几秒钟后，甲醛溶液即沸腾挥发。高锰酸钾是一种氧化剂，当它与一部分甲醛作用时，由氧化反应产生的热可使其余的甲醛挥发为气体。甲醛熏蒸接种室应至少在使用前24小时进行，熏蒸后密闭保持4小时以上再进入室内工作。甲醛对人的眼、鼻有强烈刺激作用。因此，可在使用前用氨进行中和。取与甲醛等量的氨水，倒在另一个烧杯里，迅速放入熏蒸室内，使甲醛和氨水发生中和反应，以消除甲醛味，减少对人体的刺激作用。使用氨水应在工作前2小时进行。对有材料的培养室，也可以采用乙二醇加热熏蒸2

15、. 准备组培室将组培室打扫干净，调至适宜温度3. 超净工作台处理1) 材料准备用75%酒精擦拭，准备好超净工作台内物品，包括酒精棉球、75%和90%酒精、废液缸、打火机、酒精灯、支架、镊子、解剖刀、解剖剪等2) 灭菌处理实验开始前先用75%酒精擦拭工作台面，然后开启紫外灯，紫外照射20min-30min。关闭紫外灯，开启风机10min后打开日光灯。用7075的酒精拭擦台面并消毒双手。试验用具也应该用酒精消毒。点燃酒精灯，将金属器械在其火焰上灼烧，冷却待用。注意：所有操作应在火焰近处并经过灼烧进行。金属器械不能过度灼烧，以防退火。移液管不能灼烧，培养瓶口、塑料材料、橡胶材料过火焰不能时间太长。(

16、四) 无菌苗的培养(2016/3/11)1. 培养基配制（方法同（二）培养基的配制与灭菌）种子的萌发采用1/2MS培养基1/2MS培养基贮备液贮备液贮备液贮备液蔗糖琼脂12.5mL2.5mL2.5mL2.5mL15g5g2. 马齿苋（番茄）种子处理1) 洗去浮尘和上漂的种子，挑选饱满种子，置于培养瓶中流水冲洗30min后倒掉水备用；2) 将种子置于培养瓶中，用75%酒精消毒灭菌3060s，用无菌水冲洗干净；3) 用1%升汞处理810min，然后用无菌水冲洗34次，放入无菌培养皿中，置于酒精灯火焰下方，用无菌接种器械进行分离接种。3. 接种及培养1) 用酒精擦洗工作台和手，对接种器具进行灼烧灭菌

17、；2) 打开培养瓶，瓶口在灯焰处旋转灼烧，用镊子（90%酒精浸泡并灼烧）将培养材料置于培养基上，灼烧瓶口，盖上瓶塞。3) 培养瓶贴上标签，做好标记，然后放到光照培养箱中或培养室培养架上进行培养，条件为2000-3000LX，261，培养一周。实验结果：所有马齿苋无菌苗均染菌（未拍照）实验分析：马齿苋种子消毒、灭菌时间不足接种室和培养实灭菌不彻底，环境较脏实验操作不正确超净工作台不干净(五) 愈伤组织诱导(2016/3/25)1. 培养基的配制（方法同（二）培养基的配制与灭菌）愈伤组织诱导培养基组别6-BANNA贮备液贮备液贮备液贮备液蔗糖琼脂一0.5%0.5%25mL5mL5mL5mL15g5

18、g二0.5%1%三0.5%0.5%四1%1%2. 无菌苗和外植体的处理1) 无菌苗处理从培养瓶中取出无菌苗，用无菌水洗净培养基，切成0.5cm大小，叶片较大的进行裁剪，置于无菌培养皿备用；2) 外植体处理a 将野外植物洗干净尘土并用洗衣粉刷干净；b 将洗净植物切去叶柄，将叶片从叶脉处剪开，再切成34 mm2的小块；嫩茎需切取两个节之间的节间部分，长约1 cm，流水冲洗30min；c 将外植体置于培养瓶中，用75%酒精持续消毒灭菌18s，然后用无菌水冲洗d 用1%升汞处理1215min，然后用无菌水冲洗34次，放入无菌培养皿中，置于酒精灯火焰下方，用无菌解剖刀切去两端后进行接种。3. 接种及培养

19、（同无菌苗的建立）4. 剔除长菌严重的培养瓶，其余继续培养5. 观察实验现象实验结果：组别材料染菌率枯死率存活率二马齿苋100%（2）所有叶柄基部没有散开，一起消毒75%酒精15s升汞：15min盘龙参 根00100%（2）盘龙参-叶绿色0100%盘龙参-叶基部050%（1）50%（1）苜蓿（花+叶）0花-0叶-50%花：100%叶：50%波斯菊叶00100%第一周(2016/4/8)材料马齿苋盘龙参根结果材料盘龙参叶盘龙参叶基部结果材料苜蓿花+叶波斯菊叶结果第二周(2016/4/15)材料苜蓿花+叶波斯菊叶结果开始长愈伤组织无变化愈伤组织长势良好实验分析：1、仅有无菌苗染菌：无菌苗本身染菌，

20、但未被发现； 实验培养基凝固不彻底，粘到瓶子壁上； 培养基pH未调好； 操作时，动作不正确 无菌苗仅用无菌水洗涤，未用酒精和升汞2、外植体有部分枯死：灭菌过度，时间过长3、盘龙参组织无变化：可能由于培养基中植物激素不适宜，培养室温度、光照等不恰当4、波斯菊长愈伤组织明显，此培养基较适宜波斯菊5、不同植物对植物激素的要求不同，所以在同一浓度下出现不同的结果(六) 生根实验（类似扦插）(2016/4/15)1. 生根培养基配制（方法同（二）培养基的配制与灭菌）生根培养基（1/2MS）组别6-BANNA贮备液贮备液贮备液贮备液蔗糖琼脂二00.2%12.5mL2.5mL2.5mL2.5mL15g5g三

21、0.4%四0.6%2. 无菌苗和外植体的处理1) 无菌苗处理从培养瓶中取出无菌苗，用无菌水洗净培养基，保留部分幼嫩叶片，切成0.5cm大小（材料尽量幼嫩），置于无菌培养皿备用；2) 外植体处理a 将野外植物洗干净尘土并用洗衣粉刷干净；b 将洗净植物切去老叶，保留顶端嫩叶、嫩茎，切成长约2 cm茎段，流水冲洗30min；c 将外植体置于培养瓶中，用75%酒精持续消毒灭菌18s，然后用无菌水冲洗d 用1%升汞处理13min，然后用无菌水冲洗34次，放入无菌培养皿中，置于酒精灯火焰下方，用无菌解剖刀切去两端后（约1.5cm）进行接种。3. 接种及培养（同无菌苗的建立）一瓶接种23个茎段，直接插入培养

22、基中，形态学上端朝上；4. 剔除长菌严重的培养瓶，其余继续培养5. 观察实验现象实验结果：组别材料染菌率枯死率存活率二菊花茎（1）0100%075%酒精15s升汞：15min月季茎（2）100%（2）月季花（2）第一周50%（1）第二周100%（2）女贞茎（4）0100%（1长愈伤组织、3无变化）香樟（1）100%（有愈伤）杜鹃（1）100%波斯菊茎（1）100%（略长根，第二周长菌）第一周(206/4/29)材料月季花月季茎结果绽开，无根花苞长真菌，无根长真菌，无根叶稍长，无根，未染菌材料菊花茎香樟结果褐化，无根无根有白色菌点？or愈伤组织？材料杜鹃波斯菊茎结果无根，几乎无变化长势旺盛，略微

23、生根材料女贞茎结果无变化，无根第二周(2016/5/6)其余材料均无明显变化材料月季花波斯菊结果开始枯萎，无根波斯菊开始长菌，黄色细菌，菌落光滑稍长根，但不明显综合对比不同浓度NAA对波斯菊生根的影响(2016/5/6)NAA浓度 低 高实验结果显示：较高浓度NAA诱导长根效果更好。如图所示，随NAA浓度的增加，波斯菊生根越多，长势越好(七) 生芽实验(2016/5/6)1. 生芽培养基配制（方法同（二）培养基的配制与灭菌）生芽培养基（MS）组别6-BANNA贮备液贮备液贮备液贮备液蔗糖琼脂一5%0.4%12.5mL2.5mL2.5mL2.5mL15g5g二5%0.2%三4%0.4%四4%0.

24、2%2. 无菌苗和外植体的处理（同上）1) 无菌苗处理从培养瓶中取出无菌苗，用无菌水洗净培养基，切成0.5cm大小，叶片较大的进行裁剪，置于无菌培养皿备用；2) 外植体处理a 将野外植物洗干净尘土并用洗衣粉刷干净；b 将洗净植物除叶留芽，切成长约2 cm，流水冲洗30min；c 将外植体置于培养瓶中，用75%酒精持续消毒灭菌18s，然后用无菌水冲洗d 用1%升汞处理1215min，然后用无菌水冲洗34次，放入无菌培养皿中，置于酒精灯火焰下方，用无菌解剖刀切去两端后进行接种。3. 接种及培养（同无菌苗的建立）4. 剔除长菌严重的培养瓶，其余继续培养5. 观察实验现象实验结果：组别材料染菌率枯死率

25、存活率长芽率二波斯菊第三周有染菌12.5%87.5%100%75%酒精15s升汞：15min番茄100%第一周（2016/5/20）材料波斯菊结果有部分死亡，未死亡的均已生芽，长势好该培养基适宜用于诱导波斯菊生芽材料番茄结果无生芽趋势，但是可能要长愈伤组织该培养基浓度不适宜诱导番茄生芽第二周(2016/5/27)材料波斯菊结果茎段生芽长势良好，开始形成愈伤组织材料番茄结果番茄长势较波斯菊缓慢，第二周生芽（腋芽较多），也形成愈伤组织第三周（2016/6/3）材料波斯菊结果部分长势良好，愈伤组织和芽军生长旺盛；波斯菊部分死亡，部分开始长菌，多数为真菌：1、可能是植物本身含有的菌，培养一段时间后开始

26、生长；2、培养瓶盖子上部的通气孔有破损3、培养室内不干净材料番茄结果番茄是无菌苗，未出现染菌情况。芽和其遇上组织的生长旺盛五、注意事项1. 配制培养液时应注意：1) 在使用提前配制的母液时，应在量取各种母液之前，轻轻摇动盛放母液的瓶子，如果发现瓶中有沉淀、悬浮物或被微生物污染，应立即淘汰这种母液，重新进行配制；2) 用量筒或移液管量取培养基母液之前，必须用所量取的母液将量筒或移液管润洗2次；3) 量取母液时，最好将各种母液按将要量取的顺序写在纸上，量取1种，划掉1种，以免出错。4) 溶化琼脂需要注意的是，在加热琼脂、制备培养基的过程中，操作者千万不能离开，否则沸腾的琼脂外溢，就需要重新称量、制

27、备。此外，如果没有搪瓷量杯，可用大烧杯代替。但要注意大烧杯底的外表面不能沾水，否则加热时烧杯容易炸裂，使溶液外溢，造成烫伤。2. 外植体放入培养基时，注意方向。每瓶放置外植体的数量，应该根据培养瓶瓶的大小来确定，一般放置胡萝卜4-6块。注意外植体也不要放得太少，以充分利用培养基中的营养成分。3. 接种用的酒精灯，火焰不要调得太高，接种时应靠近酒精灯火焰操作，接种的速度要快。4. 接种时严防超净工作台内着火。5. 无菌操作培养时：1) 进行培养时，动作要准确敏捷，但又不必太快，以防空气流动，增加污染机会。2) 不能用手触及已消毒器皿，如已接触，要用火焰烧灼消毒或取备品更换。3) 为拿取方便，工作台面上的用品要有合理的布局，原则上应是右手使用的东西放置在右侧，左手用品在左侧，酒精灯置于中央。4) 工作由始至终要保持一定顺序性，组织或细胞在未做处理之前，勿过早暴露在空气中。同样，培养液在未用前，不要过早开瓶；用过之后如不再重复使用，应立即封闭瓶口直立可增加落菌机会。5) 吸取营养液、细胞悬液及其它各种用液时，均应分别使用吸管，不能混用，以防扩大污染或导致细胞交叉污染。6) 工作中不能面向操作区讲话或咳嗽，以免唾沫把细菌或支原体带入工作台面发生污染。7) 手或相对较脏的物品不能经过开放的瓶口上方，瓶口最易污染，加液时如吸管尖碰到瓶口，则应将吸管丢掉。