现代分析技术综述

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1、现代分析技术在生药学中的应用姚晓(南京中医药大学药学院11硕(8)20111399江苏南京210046)摘要介绍色谱法、光谱法、核磁共振波谱、质谱及其联用技术、DNA分子诊断技术、X射线衍射法等几种现代分析方法在生药学中的应用。关键词生药学；现代分析技术ApplicationofmodernanalyticaltechnologyinPharmacognosyYAOXiao(NanjingUniversityofTraditionalChineseMedicine,Nanjing210046,China)AbstractApplicationofmodernanalyticaltechnolo

2、gyinPharmacognosyareintroducedinthispaper,includingchromatographictechniques,spectraltechniques,nuclearmagneticresonance(NMR),massspectrometry(MS,GC-MS,LC-MS,CE-MS,ICP-MS),DNAfingerprinttechniques,X-raydiffractiontechniquesKeywordsPharmacognosymodernanalyticaltechnology我们即将跨入21世纪,生命科学将对21世纪的科学发展产生重大

3、影响，生药学这一门研究生药的古老学科将面临新的挑战。以仪器分析为主的分析技术，包括高效液相色谱、薄层色谱、气相色谱、超临界流体色谱、高效毛细管电泳、红外光谱与拉曼光谱、原子吸收光谱、核磁共振、质谱及其联用技术(气质联用、液质联用、电感耦合等离子体-质谱)、DNA分子诊断技术、X射线衍射法等。伴随着生物技术、计算机技术、联用技术等新技术不断渗入，并在生药学科得到应用;围绕全球从中药中开发新药研究热点的兴起，及我国中医药走向世界面临的困境,生药学研究将以提高中药材(原料药)的质量和中药新药在国际市场上的竞争力为主要目的。我们将现代分析技术在生药学中的应用展开讨论，阐述现代分析技术在21世纪生药学研

4、究的新领域的运用。1色谱法色谱法是现代分离分析的一个重要方法，它主要包括薄层色谱、纸色谱法、气相色谱、液相色谱、凝胶色谱、超临界流体色谱、高效毛细管电泳等。色谱法是以其高超的分离能力特点，具有分离效率高、应用范围广、样品用量少、灵敏度高、易于自动化。在中药材和中成药分析中已广泛应用，成为中药质量控制的基本方法。1.1 薄层色谱薄层色谱法是将适宜的固定相涂布于玻璃板、塑料或铝基片上，成一均匀薄层，待点样、展开后，与适宜的对照物按同法在同板上所得的色谱图作对比，并可用薄层扫描仪进行扫描。TLC操作简单，具有分离、鉴定双重功能，是中药分析的常用手段。莫善列等建立喉舒宁片含量测定的薄层色谱扫描法，并用

5、该法测定不同产地样品中脱水穿心莲内酯的含量15。冯彦琳等采用薄层色谱扫描测定刺五加注射液中紫丁香苷的含量161.2纸色谱法纸色谱法是一种分配色谱，可用于氨基酸、糖类等水溶性成分的分析。1.3 气相色谱法(GC)气相色谱法(GC)是以气体为流动相，分离效率高、样品用量少、分析速度快。适用于分离、鉴别和定量测定挥发性成分。对于挥发性成分的中药，多采用气相色谱法鉴别和测定含量，在大孔吸附树脂溶剂残留检测、中药中农药残留的检测也有大量的应用。黄月纯等采用程序升温对10批石菖蒲中挥发油成分进行气相色谱分析,共标出6个特征峰,建立石菖蒲挥发油的气相指纹图谱，控制其质量1。1.4 高效液相色谱法(HPLC)

6、HPLC是以液体溶剂作为流动相的色谱技术，有分离效能高、选择性高、检测灵敏度高和分析速度快的特点。高效液相色谱法是一种非常有效并普遍实用的中药分析方法，可用于高分子、极性、离子和热不稳定性化合物的分离分析。刘永刚采用C18柱,梯度洗脱，建立藿香正气水中橙皮苷、甘草苷、厚朴酚和厚朴酚含量的测定方法6。朱文良采用HPLC法,C18柱，检测波长为203nm,同时测定复方黄芪注射液中人参皂苷Re、Rg1的含量7。1.5 超临界流体色谱超临界流体可以用作色谱的流动相，使混合物质在色谱柱上得到分离，这种分离方法被称为超临界流体色谱。超临界流体对物质的溶解能力比一般气体大的多相当于有机溶剂，但比有机溶剂的扩

7、散速度快、黏度低、表面张力小。超临界流体溶解能力的大小随其压力的变化而改变。由于超临界流体的黏度很低,SFC就可采用比高效液相色谱(HPLC)高的流速，因此具有分析/制备快的优点。SFC作为一种新的分离手段，对天然产物的分离纯化有较大优势，它既不破坏天然产物的活性，又可快速达到分离，是一种高效的分离和制备方法。王学军等采用C18色谱柱,流动相为超临界C02-005%三氟乙酸的乙醇溶液(10:1),检测波长360nm,同时测定银杏叶提取物中槲皮素和芦丁的含量21。1.6 高效毛细管电泳(HPCE)高效毛细管电泳是以高压电场为驱动力，毛细管为分离通道，依据样品中各组分之间淌度和分配行为上的差异而实

8、现分离的一类液相分离技术，具有分离效率高、速度快、所需样品少、溶剂消耗少和抗污染能力强等特点。HPCE已经日益广泛地应用于中药生药化学成分的分离、鉴别和含量测定，分析成分主要包括生物碱、黄酮、苷类、酚类、有机酸、香豆素、醌类及其它成分。吴江明等采用胶束毛细管电泳法同时测定黄连-吴茱萸药对中小檗碱、巴马汀、药根碱、吴茱萸碱和吴茱萸次碱5种主要生物碱含量24。1.7凝胶电泳根据蛋白分子大小将其分离，经染色后通过谱带的颜色深浅和数目，作为不同中药材的鉴别依据。适合于肽类、核酸、多糖等大分子化合物的分析鉴定。史克莉采用SDSPAGE电泳鉴别3种蜂王浆、金钱白花蛇、乌梢蛇、炮制前后的蝎子以及鹿蹄筋，该方

9、法为动物类中药鉴别提供可靠得鉴别特征【16】。2光谱法1.1可见一紫外分光光度法(UV)此方法原理是根据不同药材的紫外吸收光谱互异这一特性进行鉴别。一般用于总提取物或部分提取物中某类成分的含量分析，也可通过导数光谱法进行混合物中单一组分的测定，或通过指纹图谱进行定性分析。李同芬利用紫外光谱分析把柴胡、狭叶柴胡、大叶柴胡三者区分开1。汤迎爽根据子外吸收峰位置和数目的差异，鉴别了粉防己及其混淆品2。2.2 红外光谱与拉曼光谱红外光谱和拉曼光谱均属于分子振动光谱，红外光谱是有机分子的吸收光谱,而拉曼光谱是有机分子的散射光谱，二者都是利用有机物在低能量照射下分子发生振动的原理来提供结构信息，虽然二者基

10、本原理有所不同，但所得信息均丰富而且能相互补充。可提供分子中有关官能团的内在信息，“指纹”区对异构体有选择性，可进行定量及无损分析。许良等对止泻子及其两种混淆品的红外光谱进行比较,从药材的红外光谱数据可知，3种药材各有独特的红外指纹特征，其各峰位及相对强度不同，说明3种药材所含化学成分和各成分的相对含量不同，能够快速鉴别蒙药材止泻子及其混淆品地梢瓜和连翘34。2.3 原子吸收光谱(AAS)由待测元素灯发出的特征谱线通过供试品蒸气时，被蒸气中待测元素的基态原子所吸收，吸收遵循一般分光光度法的吸收定律，通过测定辐射光强度减弱的程度可求出待测元素的含量。在中草药无机微量元素含量分析上得到广泛的应用陈

11、惠玲等采用火焰原子吸收光谱法，测定粗毛淫羊藿生品及3种不同炮制品中10种微量元素的含量并作比较40。3核磁共振波谱(NMR)核磁共振波谱是一种物理方法，它检测的是组成有机化合物分子的原子核的性质及其周围化学环境的相互作用。在适当的磁场条件下，样品能够吸收射频区的电磁辐射，所吸收的辐射频率取决于样品的特性，吸收与分子中的某一给定的原子核有关,吸收峰频率对吸收峰强度作图构成NMR谱图。自1946年发现核磁共振现象以来,NMR仪器和方法迅猛发展，二维(2D)和多维NMR技术的发展就是一个突出的例子。NMR主要应用领域是测定分子的结构，中药基础研究的关键问题之一就是中药治疗疾病的物质基础研究，研究中药

12、治疗疾病的物质基础，首先就要研究清楚中药有效成分的化学结构，这已经成为中药现代化的关键内容。张庆英等利用现代1D-和2D-NMR技术对aromoline(崖藤中生物碱)的1H-NMR和13C-NMR数据进行正确全归属，并报道该化合物的CD谱44。4质谱及其联用技术质谱分析是通过对样品离子的质量和强度的测定，来进行化学成分和结构分析的一种分析方法。有机质谱能够给出有机化合物的分子量、分子式，分子离子和碎片离子、碎片离子和碎片离子之间的生缘关系，以及揭示生成碎片离子的裂解方式和有机分子结构类型关系的规律性。主要用于中草药及植物的化学成分的化学结构鉴定和测定。色谱联用技术的出现加快中药研发的步伐，该

13、技术具有所需样品量少、速度快等特点，且可得到更多信息，目前，正处于快速发展阶段并广泛应用的色谱联用技术包括气相色谱/质谱联用(GC-MS)、液相色谱/质谱联用(LC/MS)、液相色谱/质谱/质谱联用(LC/MS/MS)、毛细管电泳/质谱联用(CE/MS)、电感耦合等离子体/质谱联用(ICP-MS)等。4.1 质谱应用窦建鹏等采用电喷雾多级串联质谱(ESI-MS)技术，对从朝鲜淫羊藿分离得到的组分A、组分B分别进行指认，确定它们的化学成分，并系统研究其质谱碎裂规律与结构之间的关系，为快速鉴定这两种化合物提供一种新方法50。4.2 气质联用技术应用(GC-MS)魏刚探讨GC-MS建立中药特征指纹图

14、谱色谱条件的参数设置，建议采用特征指标成分群开展方法学(精密度、稳定性、重现性)的考察，且将相对含量的RSD值定为不得大于5%比较符合实际情况52。4.3 液质联用技术应用(LC-MS)张洁等对HPLC-ESI-MS/MS条件进行优化，研究紫杉醇电喷雾质谱的一级电离规律和二级质谱裂解规律，并结合液相色谱的保留时间判断东北红豆杉及其伤愈组织粗提物中紫杉醇色谱峰的归属56。周欣等研究用液相色谱-电喷雾质谱联用技术定量测定银杏内酯A,B,C和白果内酯BB的方法57。4.4 毛细管电泳/质谱联用技术应用（CE/MS）柳仁民等以非水毛细管电泳对粉防己甲醇提取物中的生物碱进行分离，并利用在线电喷雾离子阱质

15、谱得到的准分子离子及碎片信息对其进行鉴定；使用未涂层毛细管,50mmo1L-1醋酸铵-4%HAc-甲醇溶液为运行缓冲液，分离电压为25kV,质谱接口为同轴鞘液接口；电喷雾电压为45kv,铝毛细管温度为170C;鞘液组成为60%异丙醇-39%水-%IHAc,鞘液流速为5卩L-min-161。4.5 电感耦合等离子体/质谱应用（ICP-MS）电感耦合等离子体-质谱技术是20世纪80年代发展起来的新型的元素和同位素分析技术。与传统的元素分析技术相比，ICP-MS技术提供极低的检出限，极宽的动态线性范围、干扰少、分析精密度高、分析速度快、可提供同位素信息。它在分析能力上可取代传统的石墨炉原子吸收、电感

16、耦合等离子体光谱技术，已广泛应用于环境、半导体、生物医药分析等领域。夏斌锋等使用电感耦合等离子体质谱仪测定西洋参、丹参等10个品种药材中的铜、砷、镉、汞、铅，数据的重复性和回收率符合痕量分析要求62。5X射线衍射法X衍射技术是一种研究物质的物相和晶体结构的分析方法，被广泛应用于生产、科研等领域，在中药鉴定中的应用也日益广泛。其应用原理是当X射线通过晶体时，可以产生衍射效应，在空间形成一幅由不同晶面产生的衍射线构成的图谱，图谱包含了反映晶体空间结构的信息（Fourier变换），通过计算（Fourier反变换）可获得晶体分子精确的三维立体结构。如果被测定物质是混合物，所得的应是各组分衍射效应的叠加

17、，故只要成分恒定，图谱也就恒定。中药粉末X衍射图谱是其所含全部成分的一次Fourier变换，它与所含化学成分呈一一对应的关系。因此，可通过X衍射Fourier谱分析，获得每种中药特定的X衍射图谱，实现对中药的鉴定3-4。在中药鉴定中的应用主要有以下几方面。5.1在植物类中药中的应用周俊国等5对3种不同产地12个样品的蛇床子进行粉末X射线衍射分析，结果表明，不同产地蛇床子衍射图谱按其几何拓扑大致可分为4类相似的衍射模糊图形，与TCL法分析的结果一致，为中药鉴定提供了新的谱学分析依据。5.2在动物类中药中的应用李兰燕等6采用粉末X射线衍射Fourier谱鉴定法，对1个广地龙药材对照品、4个广地龙中

18、药材进行实验分析，结果得到了其标准X射线衍射Fourier图谱及特征标记峰值。结果表明5个广地龙样品的X射线衍Fourier图谱几何拓扑图形规律是一致的。5.3在矿物类中药中的应用古令等7分析了8种马宝和一种伪马宝的成分，证明了正品和伪品的化学成分完全不同。5.4在菌类中药中的应用X射线衍射法同样已在菌类中药中得到了应用。如罗俊等8报道，采用波谱和X射线衍射分析赤芝子实体的化学结构，分离得到4个化合物，鉴定为麦角甾醇、麦角甾-7,22-二烯-3B-醇和两个新化合物。6计算机模式分类技术原理是采用先进的色谱和光谱分析进行化学量测，从中获取中药质量优劣的化学信息，用计算机模式分类技术进行分类决策，

19、依此来鉴定中药。不同的中药样品在化学成分及含量上存在着差异，可用色谱和光谱等反映出来，并将从色谱、光谱中提取的有用信息特征转化为计算机能够接受n行m列数量化矩阵，属于不同类别的样品则相互分离。主要的计算机模式分类技术有K最近邻分类法(KNN)、非线形映照法(NLM)、主成分分析法(PCA)、SIMC法、PRIMA法、星区图法、模糊聚类分析法、人工神经网络法等。计算机模式技术用于中药鉴定与当前国家对中药质量现代化研究的宏观要求相吻合。苏薇薇从5种黄芬的薄层色谱中获取分类特征，用模糊聚类分析法准确的区分了药典规定的正品黄琴与4种非正品黄芬在所含化学成分上差异的大小19o7分子生物技术传统的中药鉴别

20、主要依据形态学特征和理化性质，但是最具有决定意义的应该是DNA鉴定，因为物种的差异归根结底是由于它们DNA之间的核酸序列不同，中药的DNA鉴定即中药的DNA指纹图构建，通过对中药品种基因组的直接分析，不仅有助于正本清源，而且对于建立我国一些地道名贵中药材的基因库，了解这些品种的遗传变迁状况及代用品间血缘关系远近都有重大意义。可应用于药用植物鉴别的分子生物学方法主要有：限制性片段长度多态性(RFLP)、随机扩增多态性DNA(RAPD)、扩增片段长度多态性(AFLP)、随机引物PCR(AP一PCR)、DNA指纹技术(DAF)和生物芯片术等。7.1限制性片段多态性(RFLP)限制性片段多态性(RFL

21、P)是依据不同植物个体来源的DNA所形成的不同的谱带模型与低拷贝的DNA探针杂交得到DNA的限制性片段多态性，它代表的是基因组DNA在限制性内切酶消化后产生的片段在长度上的差异。其结果稳定可靠，重复性好，但是操作复杂，费用高，易造成污染，应用较少。张婷利用PCRRFLP成功鉴定了25件市售束花石、解、流苏石解及其形态相似种21。7.2随机扩增多态性DNA(RAPD)随机扩增多态性DNA(RAPD)原理是根据DNA聚合酶链反应技术(PCR)，采用人工合成的随机引物，以植物组织分离的基因组DNA为模板，进行多态性DNA片段的随机合成反应，从而根据DNA片段，将植物不同基因组予以区别。张艳波等收集了

22、6种拘祀属植物，7个正品，4个混淆品，运用RAPD技术，获得了构祀属不同种植物的DNA指纹图谱，为构祀地道品种鉴别提供分子水平的依据。曹晖采用任意引物聚合酶链反应和随意引物扩增的多态性DNA方法，扩增蒲公英及其6种土公英混淆品的基因组DNA，获得清晰并可靠的DNA指纹图谱，根据琼脂糖凝胶上显示的DNA带型差异可鉴别蒲公英及其混淆品22o7.3扩增片段长度多态性(AFLP)扩增片段长度多态性(AFLP)是RFLP和RAPD两种技术相结合的一种分子标记技术，既有RFLP的专一性、可靠性，又有RAPD技术的随机性、方便性。YamaZaki利用AFLP鉴别甘草属植物23。7.4DNA测序法以PCR扩增

23、产物作为测序引物，提高了DNA序列分析的效率。马小军通过比较不同人参的ITS序列进行鉴别24o7.5生物芯片生物芯片是将大量探针分子(DNA，RNA或多肽)固定在支持物上后与标记的样品分子进行杂交，通过检测每个探针分子的杂交信号强度，对样品分子进行定性、定量和结构分析。李绍平采用生物芯片鉴定川贝母25o8结语本文对现代分析技术在生药分析中应用作了简要综述与分析。由每种技术各有优缺点和适用对象，故在生药分析的实际应用中可从材料特点、实验条件和已有的研究基础出发，选择一种或几种方法，以找出快速有效、经济稳定的实用基因技术以分析生药。相信随着PCR，DNA测序，核昔酸引物合成、核酸内切酶分离纯化等技

24、术向低成本商业化(试剂盒)、高效率自动化(分析仪器)方向发展，不久的将来以内切酸探针和引物探针为代表的基因技术PCR分析法有可能成为继显微、理化方法之后生药分析领域又一常规分子分析方法。应用此方法只要选择特异的探针通过PCR扩增或酶解，电泳分离即可达到生药分析目的。参考文献1 李萍，徐国钧，徐珞珊.21世纪生药学研究展望J.中国药学杂志，1997，32(9)：7 513517J.中国药房,2005,16(21)黄月纯，魏刚.石菖蒲挥发油的气相色谱指纹图谱研究16661677J.中成药,2005,莫善列，思秀玲，韦松.薄层扫描法测定喉舒宁片中脱水穿心莲内酯的含量27(12):14811482冯彦

25、琳，李美萍，李俊.薄层色谱扫描法测定刺五加注射液中紫丁香苷的含量J.药物分析杂志,2006,26(6):8538544种成分的含量J.刘永刚，卢建秋，刘珍清，等.高效液相色谱法测定藿香正气水中橙皮苷等时珍国医国药，2006,17(10):19471948朱文良，李发美.HPLC法同时测定复方黄芪注射液中人参皂苷Re、Rg1含量，2006,23(9):577580王学军，许振良，赵锁奇.银杏叶提取物中槲皮素和芦丁的超临界流体色谱法测定J.中国医药工业杂志，2005,36(7):41541吴江明，栾连军，程翼宇.胶束毛细管电泳法同时测定黄连-吴茱萸药对5种生物碱的含量J.8 药物分析杂志，2006

26、,26(3):325328史克莉等.几种动物类中药材SDS-PAGE的电泳鉴别J.中成药.2004,(5):411李同芬等.北柴胡、南柴胡与大叶柴胡紫外光谱及导数光谱指纹鉴别J.中草药.1990:9 (3):31汤迎爽等.紫外光谱法鉴别粉防己及其混淆品木防己、小果微花藤J.时珍国医国药.2003,(1):26许良，王志民,吴香杰等.止泻子及其混淆品的傅立叶变换红外光谱法鉴别J.时珍国医国药,2006,17(1):7980陈惠玲，王建科,任永全等.粗毛淫羊藿及其不同炮制品中10种微量元素的含量J.中国中药杂志,2001,26(3):159161张庆英，梁鸿,蔡少青，等.崖藤中生物碱aromoli

27、ne的结构及NMR研究J冲草药,2005,36(11):16271629窦建鹏，刘志强，刘淑莹.两种黄酮醇苷同分异构体的电喷雾质谱区分N.质谱学报，2004,25(增刊):5354魏刚.气相色谱-质谱联用建立中药特征指纹图谱的色谱条件探讨J.时珍国医国药，2005,16(8):728729张洁,段继诚，梁振，等.东北红豆杉及其伤愈组织粗提物中紫杉醇HPLC-ESI-MS/MS分析研究N.药学学报,2006,41(9):863866周欣,张雪琴,袁牧等.液相色谱-电喷雾质谱定量测定银杏内酯的研究J.中国中药杂志，2005,30(24):19151918柳仁民，何风云,孙爱玲.毛细管电泳-电喷雾-

28、质谱-质谱分离鉴定粉防己生物碱N.药学学报,2004,39(5):363366夏斌锋，卢祖庆,王欣美等.ICP-MS法测定中药材中5种有害元素方法的研究J.现代仪器,2004,10(1):172裘汉幸.X衍射技术在中药鉴定中的应用新进展J.中国药业，2005,14(7):89.10 黄燕，娄国菁.X射线衍射法在中药鉴定中的应用J.山东中医杂志，2004,23(4):232.周俊国，吕扬，郑启泰，等中药材蛇床子的粉末X射线衍射研究J.中草药，1999,30(1):5961.11 李兰燕，王树春，吴云山，等.广地龙的X射线衍射Fourier谱鉴定J.中成药，2002,24(3):380.12 古今

29、，刘萍.中药鉴定技术的新进展J.解放军药学学报，2002,18(4):224.13 罗俊，林志彬.波谱和X-衍射分析鉴定赤芝子实体三萜类化合物的结构J.中草药，2002,33(3):197苏薇薇.聚类分析法在黄芬鉴别分类中的应用J.中国中药杂志.1991,(10):579张婷.药用植物束花石解、流苏石解及其形态相似种的PCR-RFLP鉴别研究N.药学学报，2005,(8):728曹晖.香港市售蒲公英及其混淆品土公英的DNA指纹鉴别研究J.中国中药杂志，1997,(4):197YamazakiM.GeneticrelationsamongGlycyrrhizaeplantsdeterminedbyRAPDandRFLPanalysisJ.BiolPharmBull,1994,(17):1529马小军.野山参与栽培参rDNA内转录间隔区(11)序列比较J.中国中药杂志，2000,25(4):206李绍平.生物芯片技术在中药鉴定研究中的应用于展望J.世界科学技术，2000,2(3):14 158曹晖.中日基因技术在生药分析中的研究进展J.现代药物分析论坛1999,1:51-57