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1、实验六、人类外周血染色体标本的制备实验六、人类外周血染色体标本的制备实验目的实验目的 学习外周血淋巴细胞悬浮培养的原理和方法，学习外周血淋巴细胞悬浮培养的原理和方法，利用培养后进行分裂的细胞制备人类染色体利用培养后进行分裂的细胞制备人类染色体标本标本 了解人类染色体的基本形态特点，为核型分了解人类染色体的基本形态特点，为核型分析和原位杂交实验提供良好的染色体标本析和原位杂交实验提供良好的染色体标本实验原理实验原理 外周血中的淋巴细胞几乎都处于外周血中的淋巴细胞几乎都处于G0期或期或G1期，一般情况下是不分裂的。但是加入植期，一般情况下是不分裂的。但是加入植物血凝素时，小淋巴细胞受刺激转化为淋物
2、血凝素时，小淋巴细胞受刺激转化为淋巴母细胞，并开始进行有丝分裂。经短期巴母细胞，并开始进行有丝分裂。经短期培养后，用秋水仙素处理、低渗、固定、培养后，用秋水仙素处理、低渗、固定、滴片和染色，就可获得大量中期分裂相的滴片和染色，就可获得大量中期分裂相的细胞进行观察。细胞进行观察。实验原理实验原理 此方法是此方法是Moorhead于于1960年建立。在人年建立。在人类遗传分析中普遍采用外周血培养的方法类遗传分析中普遍采用外周血培养的方法获取分裂相细胞，进而开展临床和基础遗获取分裂相细胞，进而开展临床和基础遗传学的研究，这对于遗传疾病的检出以及传学的研究，这对于遗传疾病的检出以及遗传咨询等工作发挥重
3、要作用。遗传咨询等工作发挥重要作用。器具器具 隔水式恒温培养箱，恒温水浴箱，离心机，隔水式恒温培养箱，恒温水浴箱，离心机，显微镜，刻度离心管、吸管、试管架，载显微镜，刻度离心管、吸管、试管架，载玻片等。玻片等。试剂试剂 抗凝人外周血（淋巴细胞），抗凝人外周血（淋巴细胞），淋巴细胞淋巴细胞培培养液（可直接购买），秋水仙素养液（可直接购买），秋水仙素（10g/ml），），0.075 mol/L KCL低渗液，低渗液，磷酸缓冲液（磷酸缓冲液（pH6.8），甲醇、冰醋酸、吉），甲醇、冰醋酸、吉姆萨（姆萨（Giemsa）原液）原液取加入肝素抗凝的外周血取加入肝素抗凝的外周血加植物血凝素加植物血凝素PHA
4、，37培养淋巴细胞培养淋巴细胞72h秋水仙素处理细胞，细秋水仙素处理细胞，细胞停止分裂，停滞在细胞停止分裂，停滞在细胞分裂中期胞分裂中期KCl进行低渗处进行低渗处理理离心收集细胞离心收集细胞离心收集细胞离心收集细胞固定细胞固定细胞预固定细胞预固定细胞离心收集细胞离心收集细胞滴片，气干滴片，气干离心收集细胞离心收集细胞操作步骤操作步骤 1.用一次性注射器抽取抗凝血用一次性注射器抽取抗凝血1ml，将针头，将针头插入含有淋巴细胞培养液的培养瓶内，每插入含有淋巴细胞培养液的培养瓶内，每瓶滴入瓶滴入24-28滴血，摇匀。置滴血，摇匀。置37恒温中培恒温中培养养72小时，其间可摇动小时，其间可摇动2-3次
5、。次。操作步骤操作步骤 2.在终止培养前在终止培养前2-3小时，加入秋水仙素，小时，加入秋水仙素，终浓度终浓度0.2g/ml，轻轻摇匀，放回培养箱，轻轻摇匀，放回培养箱中继续培养。中继续培养。 注意：秋水仙素的处理时间不要少于注意：秋水仙素的处理时间不要少于4小时，小时，也不要超过也不要超过6小时。小时。 操作步骤操作步骤 3.将培养物倒入刻度离心管内，以将培养物倒入刻度离心管内，以1000r/min离心离心10分钟，弃去上清液，留底分钟，弃去上清液，留底层沉淀物。层沉淀物。操作步骤操作步骤 4.加入加入37预温的预温的0.075mol/L KCL低渗液低渗液8ml，用吸管混合均匀，置，用吸管
6、混合均匀，置37，恒温水浴，恒温水浴箱中低渗箱中低渗25-30分钟。分钟。 处理目的：使红细胞破坏处理目的：使红细胞破坏,淋巴细胞膨胀淋巴细胞膨胀,染染色体分散。低渗的时间、温度会影响染色体色体分散。低渗的时间、温度会影响染色体的分散和分裂相的数目。的分散和分裂相的数目。操作步骤操作步骤 5.加入加入1ml新配制的固定液（甲醇：冰醋酸新配制的固定液（甲醇：冰醋酸3：1）进行预固定，轻轻混合均匀，吹打混）进行预固定，轻轻混合均匀，吹打混匀，一般匀，一般20几次几次 ，1000r/min离心离心6分钟，分钟，弃去上清液。弃去上清液。 注意：此步骤的的吹打较为重要，一定要有注意：此步骤的的吹打较为重
7、要，一定要有一定力度一定力度操作步骤操作步骤 6.加入加入8ml新配制的固定液（甲醇：冰醋酸新配制的固定液（甲醇：冰醋酸3：1），不停），不停吹打吹打细胞，室温下固定细胞，室温下固定30min，1500r/min离心离心6分钟，弃去上清分钟，弃去上清液。液。操作步骤操作步骤 7.根据细胞数量的多少适当加入根据细胞数量的多少适当加入0.2-0.4ml新新配制的固定液（甲醇：冰醋酸配制的固定液（甲醇：冰醋酸3：1），），吹吹打打细胞制成悬液。细胞制成悬液。操作步骤操作步骤 8.吸取少量细胞悬液，尽量高距离地吸取少量细胞悬液，尽量高距离地（2030cm）滴）滴2-3滴于冰水浸泡过的载玻滴于冰水浸泡过
8、的载玻片上，吹散，气干。片上，吹散，气干。操作步骤操作步骤 9.取取3滴吉姆萨原液加滴吉姆萨原液加10滴磷酸缓冲液，混滴磷酸缓冲液，混匀后滴在玻片标本上，染色匀后滴在玻片标本上，染色6-8min。流水。流水轻轻冲洗玻片背面，将染液冲掉；气干。轻轻冲洗玻片背面，将染液冲掉；气干。操作步骤操作步骤 10.显微镜高倍镜和油镜下观察染色体标本显微镜高倍镜和油镜下观察染色体标本分裂相的多少及分散情况。分裂相的多少及分散情况。G显带染色体标本制备与识别显带染色体标本制备与识别实验原理实验原理 人们将用各种不同的方法，以及用不同的染料处理人们将用各种不同的方法，以及用不同的染料处理染色体标本后，使每条染色体
9、上出现明暗相间，或染色体标本后，使每条染色体上出现明暗相间，或深浅不同带纹的技术称为显带技术（深浅不同带纹的技术称为显带技术（banding technique）。本世纪）。本世纪70年代以来，显带技术得到年代以来，显带技术得到了很大发展，且在众多的显带技术中（了很大发展，且在众多的显带技术中（Q带、带、G带、带、C带、带、R带、带、T带），带），G带是目前被广泛应用的一种带是目前被广泛应用的一种带型。因为它主要是被带型。因为它主要是被Giemsa染料染色后而显带，染料染色后而显带，故称之为故称之为G显带技术，其所显示的带纹分布在整个显带技术，其所显示的带纹分布在整个染色体上。染色体上。实验原
10、理实验原理 研究发现，人染色体标本经胰蛋白酶、研究发现，人染色体标本经胰蛋白酶、NaOH、柠、柠檬酸盐或尿素等试剂处理后，再用檬酸盐或尿素等试剂处理后，再用Giemsa染色，染色，可使每条染色体上显示出深浅交替的横纹，这就是可使每条染色体上显示出深浅交替的横纹，这就是染色体的染色体的G带。每条染色体都有其较为恒定的带纹带。每条染色体都有其较为恒定的带纹特征，所以特征，所以G显带后，可以较为准确的识别每条染显带后，可以较为准确的识别每条染色体，并可发现染色体上较细微的结构畸变。色体，并可发现染色体上较细微的结构畸变。 实验原理实验原理 G显带的机理：一般认为，易着色的阳性带显带的机理：一般认为，
11、易着色的阳性带为含有为含有AT多的染色体节段，相反，含多的染色体节段，相反，含GC多多的染色体段则不易着色。总的来说，的染色体段则不易着色。总的来说，G显带显带的机理还未搞清。的机理还未搞清。 实验步骤实验步骤 1. 将常规制备的人染色体玻片标本将常规制备的人染色体玻片标本(未染色未染色的白片的白片)置于置于37烤箱中处理烤箱中处理2 h，然后转入，然后转入37培养箱中备用，一般在第培养箱中备用，一般在第37天进行显天进行显带。带。 2 .取取0.25胰酶溶液胰酶溶液5 ml，倒入染色缸中，倒入染色缸中，加入加入45 ml生理盐水，生理盐水，1 mol/L NaOH及酚红及酚红调节胰酶溶液成肉
12、汤色调节胰酶溶液成肉汤色(pH 6.87.2)。实验步骤实验步骤 3将配好的胰蛋白酶工作液放人将配好的胰蛋白酶工作液放人37恒温恒温水浴箱中预温。水浴箱中预温。 4将玻片标本浸入胰蛋白酶液中，不断摆将玻片标本浸入胰蛋白酶液中，不断摆动使胰蛋白酶的作用均匀，处理动使胰蛋白酶的作用均匀，处理45min (精确的时间自行摸索精确的时间自行摸索)。实验步骤实验步骤 5. 立即取出玻片，放入生理盐水中漂洗两次。立即取出玻片，放入生理盐水中漂洗两次。 6. 将标本浸入将标本浸入37预温的预温的Giemsa工作液工作液(Giemsa原液和原液和pH 6.8的磷酸缓冲液比例为的磷酸缓冲液比例为1:10)中染色
13、中染色10min左右。左右。实验步骤实验步骤 7. 自来水冲洗自来水冲洗(用细水小心冲洗用细水小心冲洗)，空气干燥。，空气干燥。 8. 镜检显带效果。在低倍镜下选择分散良好的镜检显带效果。在低倍镜下选择分散良好的长度适中的分裂相，转换油镜观察，若染色体长度适中的分裂相，转换油镜观察，若染色体未出现带纹，则为显带不足；若染色体边缘发未出现带纹，则为显带不足；若染色体边缘发毛为显带过头，此时应根据具体情况增减胰蛋毛为显带过头，此时应根据具体情况增减胰蛋白酶处理时间重新处理一张标本。白酶处理时间重新处理一张标本。思考题思考题1、简述人类染色体制备的操作过程和基本原理、简述人类染色体制备的操作过程和基本原理2、总结人类染色体制备过程中的关键步骤及注、总结人类染色体制备过程中的关键步骤及注意事项意事项
遗传学实验课：实验六、人类外周血染色体标本制备
