分子生物学02

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1、生物大分子的概述（由小分子到大分子）生物大分子的概述生物大分子的概述蛋白质的一级结构是指肽链中氨基酸的排列顺序蛋白质的二级结构是指邻近几个氨基酸形成的一定的结构形状。如螺旋和折叠。蛋白质的三级结构是指整条肽链盘绕折叠形成一 定的空间结构形状。如纤维蛋白和球状蛋白。蛋白质的四级结构是指各条肽链之间的位置和结 构。所以，四级结构只存 在于由两条肽链以 上组成的蛋白质。生物大分子的概述生物大分子的概述一级结构二级结构三级结构四级结构螺旋螺旋折叠折叠生物大分子的概述血红蛋白质的三级结构和四级结构生物大分子的概述生物大分子的概述Nucleotide (Nt) basic unitDNA和RNA之间的区别

2、？生物大分子的概述 (1) (1) 碱基碱基糖之间是糖之间是糖苷键糖苷键 (2) (2) 糖糖磷酸之间是磷酸酯键磷酸之间是磷酸酯键 生物大分子的概述生物大分子的概述 不同高级结构带来不同的生物学性能 淀粉形成螺旋状形成螺旋状 能源贮存 纤维素呈长纤维状 结构支架生物大分子的概述生物大分子的概述淀 粉糖 元纤维素生物大分子的概述生物大分子的概述生物大分子的概述生物大分子的概述生物大分子的概述DNA的结构和性质DNA是作为主要的遗传物质的优点？是作为主要的遗传物质的优点？DNA的结构和性质（1 1） DNADNA双螺旋双螺旋A、两条反向平行的核苷酸链共同盘绕形成双螺 旋，糖磷酸糖构成螺旋主链B、两

3、条链的碱基都位于中间，碱基平面与螺旋轴垂直C、两条链对应碱基呈配对关系 AT GCD、螺旋直径 20A，螺距 34A，每一螺距中含 10 bp DNA 双螺旋可以看作是 DNA 的二级结构 DNA 的三级结构的形成需要蛋白质帮助DNA的结构和性质 DNA的结构和性质l 碱基顶部基团裸露在碱基顶部基团裸露在DNA 大沟大沟内内l 蛋白质因子与蛋白质因子与DNA 的特异结合依赖于的特异结合依赖于 氨基酸与氨基酸与DNA 间的氢键的形成间的氢键的形成l 蛋白质因子沿蛋白质因子沿大沟大沟与与DNA形成专一性形成专一性 结合的机率与多样性结合的机率与多样性高于沿高于沿小沟小沟的结合的结合l 大沟的空间大

4、沟的空间更有利于与蛋白质的结合更有利于与蛋白质的结合 (2) DNA(2) DNA双螺旋的结构特点双螺旋的结构特点DNA的结构和性质Right handed B-form DNA Right handed B-form DNA Double helix Model Double helix Model 每一单链具有 5 3极性 两条单链间以氢键 连接 两条单链，极性相 反，反向平行 以中心为轴， 向 右 盘 旋 (B-form) 双 螺 旋 中 存 在 大沟 (2. 2nm) 小 沟 (1. 2nm)DNA的结构和性质DNA的结构和性质DNA的分子构型的分子构型 ( B, Z, A ) 比较比

5、较 DNA的结构和性质DNA的结构和性质DNA的结构和性质 DNA分子变性分子变性( DNA denaturation ) D.S. DNAS.S. DNA ( 加温加温, 极端极端pH, 尿素尿素, 酰胺酰胺 ) DNA的结构和性质DNA的结构和性质DNA的结构和性质1.1851.01.37ODConcentration 50g/ml Opetical Density D.S DNA A260 = 1S.S DNA A260 = 1.37dNTPs A260 = 1.60 = OD增加值的中点温度增加值的中点温度(一般为一般为85-95) Tm (melting temperature) =

6、 midpoint of the temperature range over which DNA is denatured DNA的结构和性质l 增色效应增色效应的跳跃现象的跳跃现象 ( Jump of Hyperchromicity )高分子量的高分子量的DNA分子在热变性过程中分子在热变性过程中, 富含富含AT区域区域首先发生首先发生 变性变性, 然后逐步扩展然后逐步扩展, 表现增色效应的跳跃表现增色效应的跳跃现象现象, 使变性过程加快使变性过程加快. rich AT rich AT DNA的结构和性质Tm = 69.3 + 0.41 GC% DNA的结构和性质DNA的结构和性质 碱基堆

7、积碱基堆积本身本身也是一种协同作也是一种协同作用。在碱基堆积用。在碱基堆积中，处于中间的中，处于中间的碱基比处于两边碱基比处于两边的碱基要稳定，的碱基要稳定，两边的碱基越多，两边的碱基越多，中间的碱基越稳中间的碱基越稳定定 DNA的结构和性质DNA的结构和性质DNA的结构和性质DNA的结构和性质DNA的结构和性质DNA的结构和性质 超螺旋结构超螺旋结构DNA 绝大多数原核生物的绝大多数原核生物的DNA 共价闭合环的分子结构共价闭合环的分子结构真核生物染色体真核生物染色体 线形分子线形分子DNA 组蛋白组蛋白多级螺旋多级螺旋多个类似环型的结构多个类似环型的结构DNA的结构和性质 超螺旋结构超螺旋

8、结构DNA leads to left-handed superhelix B-DNAoverwindingoverwinding (右旋右旋) positive positive supercoiledsupercoiled DNA的结构和性质Leads to right-handed superhelixB-DNAunwindingunwinding (左旋左旋) 所有生物的所有生物的DNA几乎几乎 有有5%为为 Negative Superhelix Negative Supercoiled DNA的结构和性质超螺旋发生的规律超螺旋发生的规律Vinograd. J (1968)Vinog

9、rad equationL = T + W ( = + )L Linking number ( 双链双链DNA的交叉数的交叉数)T Twisting number (双链双链DNA的缠绕数，初级螺旋圈数，可为小数的缠绕数，初级螺旋圈数，可为小数)W Writhing number (直观上为双螺旋数直观上为双螺旋数 可为小数可为小数)W= 负值（负值（negative superhelix）W = 正值正值 ( positive superhelix） Non-breaking Non-unwinding Non-overwindingL为定值，整数为定值，整数DNA的结构和性质超超 螺螺 旋

10、旋 形形 成成 示示 意意末端固定的线型双螺旋末端固定的线型双螺旋额外的张力不能释放额外的张力不能释放双螺旋以扭曲方式缓双螺旋以扭曲方式缓解应力，形成超螺旋解应力，形成超螺旋DNA的结构和性质l B-DNA是力学上稳定是力学上稳定的结构（的结构（ 10 bp/ helix）l l 虽交叉数减少，但需转虽交叉数减少，但需转换为一种应力，以维持换为一种应力，以维持10bp/helix的螺旋数，的螺旋数，l 应力的重新分配应力的重新分配 或在或在B-DNA状态中保留一状态中保留一单链区单链区或螺旋力将维持或螺旋力将维持B-DNA的的右旋结构右旋结构, 形成超螺旋形成超螺旋 420bpL=42T=42

11、W=0无无应力应力松弛状态松弛状态应力的分配应力的分配L = 36T = 36W = 0L = 36T = 42W = -6 链松弛后链松弛后再结成环再结成环链未松弛链未松弛再结成环再结成环松开松开6圈螺旋圈螺旋L = 6DNA的结构和性质In vitroEB insertedNeg. Pos.Superhelix changeL (linking Num.)不变不变T (Twisting Num.)减少减少(-26o/helix / 0ne of EB inserted) L= T+WW = L - T = 正值正值 DNA向紧缩方向发展向紧缩方向发展 base base3.4埃埃EB 7.

12、0埃埃 base basebasebaseDNA的结构和性质360o/helix 360o-26o/helix / 0ne of EB insertedNeg. Superhelix OC, L, DNA Pos. Superhelix EB对超螺旋结构的影响对超螺旋结构的影响DNA的结构和性质超螺旋的生物学意义主要是：其一，超螺旋形式是DNA复制和转录的需要(即基因表达的需要)。其二，可以使巨大的DNA分子的体积缩小。 DNA的结构和性质DNA的结构和性质DNA的分子构型的分子构型 ( B, Z, A ) 比较比较 DNA的结构和性质 复性过程依赖于单链分子间的随机碰撞复性过程依赖于单链分子

13、间的随机碰撞 ( Depends on the collision of complementary S.S. DNA ) DNA的结构和性质DNA的结构和性质DNA的结构和性质复性发生的过程的讨论复性发生的过程的讨论遵循second order kinetics formula （二级反应动力学）二级反应动力学）dCt / dt = -KCt2 反应初始反应初始 t = 0 两条部分同源两条部分同源(小于小于20dNt)的的S.S. DNA, 在复性过程中在复性过程中 形成的部分双链区是不稳定的形成的部分双链区是不稳定的 单链单链DNA的随机碰撞的随机碰撞 过程（过程（ randomly c

14、ollision ）单链单链 DNA浓度浓度 = C0反应达反应达 t 时时单链单链DNA浓度浓度 = CtDNA的结构和性质 dCt / dt = -KCt2 积分 Ct / C0 = 1 / 1+KC0t 当 Ct / C0 = 1/2 时Ct / C0 = 1/2 = 1 / 1+ KC0t(1/2)K = 1 / Cot(1/2)Cot(1/2) = 1/K (mol. Sec / L) 任一DNA分子达到Ct / C0 = 的速率 是定值DNA的结构和性质在控制反应条件相同的前提下在控制反应条件相同的前提下, 两种两种DNA分子的分子的C0t(1/2)值值, 取决于取决于dNt 的排

15、列复杂性的排列复杂性 ( 复性动力学的复杂性复性动力学的复杂性, Kinetic complexity, K.C ) AAAAAAAA K. C. = 1 C0t(1/2) = 210-6ATCGATCGATCG K.C. = 4 K.C. = 5 105 C0t(1/2) = 1Ct/C0 0101C0t(1/2) C0t(1/2) Fraction reassociatedDNA的结构和性质DNA的结构和性质DNA的结构和性质DNA的结构和性质（1）酸水解）酸水解（2）碱水解）碱水解 pH 13时，时，RNA水解而水解而DNA稳定稳定 （3）酶水解）酶水解 DNA酶酶(DNase) RNA

16、酶酶(RNase) 外切核酸酶外切核酸酶 5，专一性和专一性和3，专一性专一性 内切核酸酶内切核酸酶 核酸酶有多种生物学功能，已经成为实验室中人们核酸酶有多种生物学功能，已经成为实验室中人们 随意切除核苷酸的有用工具随意切除核苷酸的有用工具（4）s1内切核酸酶和内切核酸酶和s1图谱图谱 1.S1酶确定某一基因突变的位点酶确定某一基因突变的位点 2.S12.S1酶还可以用于确定转录起始点酶还可以用于确定转录起始点 DNA的结构和性质RNA大肠杆菌中RNA的含量和性质RNA真核生物中RNA的存在和分类 RNARNARNARNARNARNA 1972. Herbert Boyer1972. Herb

17、ert Boyer 限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶II (RE-II) 1975.1975. Sanger C.Sanger C. 1976. “ , ” 法法 1977.1977.MaxamMaxam Gilbert Gilbert 1978. 化学测序法化学测序法 1977.1977. Sanger C.Sanger C. 1978. ddNTP法法 2002. 2002. PyroPyro-sequencing-sequencing RNA “ , ” 法法 Terminal Deoxynucleotide Transferase (TDT) 7-12 oligo-dT as temp

18、late of primer dXTP32 + 3dNTP in primer DNA polymerase 在低温下可合成不同长度的在低温下可合成不同长度的DNA分子分子 “”系统，系统， 仅加入仅加入一种一种dXTP DNA polymerase D. S. DNA clone S. S. DNA as template polymerizing 5 3 DNA strand stop in dXTP pyro-phospholysis RNA “” 系统，加入系统，加入3种种dNTP ( 缺一种缺一种dXTP ) DNA strand stop front dXTP PAGE for f

19、ractionating of DNA fragments 3 ATGCTG 5 5 AAA low temperature low temperature 5 TACGAC TACGATACGTTACTAe.g.RNA “减减”系统系统（-T）stop front T5 TACGAC 5 TACGAC TACGAC TACGA TACG TACG TACG TAC TACG TA T T (-A) stop front A (+A) stop in AT“加加”系统系统（+T）stop in TTACGTACGAC55 TACGACTACGATACTA 3 ATGCTG 3 ATGCTGCC

20、ACAGCAGCCAGCATACGATACGTTACTARNA5 TACGAC 5 TACGAC TACGAC TACGA TACGAC TACG TAC TAC TAC TA TAC T 5 TACGAC 5 TACGAC TACGA TACGA TACGA TACG TACGA TAC TA TA TA T (-C) stop front C (+C) stop in C(-G) stop front G (+G) stop in GRNA8反应系统反应系统DNA 8M urea denature PAGE sequencing 5 -1 2 3 4 5 6- 3(+) TACGAC3-

21、ATGCTG - 5(-) ACGACRNA化学测序法化学测序法 Chemical sequencingChemical sequencing G系统；系统； pH 8.0 硫酸二甲酯硫酸二甲酯 G m7G C8N9断裂断裂 脱脱G A+G系统；系统；pH 2.0 哌啶甲酸哌啶甲酸（pidinepidine） 嘌呤环嘌呤环 N质子化质子化 脱嘌呤脱嘌呤 C系统；系统； 1.5 mol/L NaCl C + 肼（肼（hydrazinehydrazine） 脱脱C T + C系统；系统； 肼肼(hydrazine)(hydrazine) 打开嘧啶环打开嘧啶环 重新重新5C环化环化脱嘧啶脱嘧啶 RN

22、AChemical sequencingChemical sequencing G系统系统 脱脱G A+G系统系统 脱嘌呤脱嘌呤 C系统系统 脱脱C T + C系统系统 脱嘧啶脱嘧啶 RNA双脱氧法双脱氧法 H H N 4ddNTP系统中系统中DNA链均终止链均终止在在ddXMP 36913RNA ATP sulfurylase PPi+APS ATP (adenosine 5phosphosulfate) 腺苷-5-磷酸硫酸酐 Luciferase Luciferin oxyluciferin Pyro-sequencingRNAPyro-sequencingRNAprimerRNARNA蛋

23、白质蛋白质蛋白质蛋白质蛋白质蛋白质一级结构二级结构三级结构四级结构蛋白质蛋白质蛋白质蛋白质蛋白质蛋白质蛋白质蛋白质2、多亚基蛋白质的调节、多亚基蛋白质的调节变构变构 蛋白质蛋白质蛋白质蛋白质变构的主要模型蛋白质蛋白质蛋白质蛋白质汞化物汞化物巯基乙醇巯基乙醇+完整的酶分子完整的酶分子（活性形式）（活性形式）催化亚基催化亚基（三聚体）（三聚体）调节亚基调节亚基（二聚体）（二聚体） C R 蛋白质蛋白质蛋白质蛋白质蛋白质蛋白质cdk蛋白的三维结构 蛋白质蛋白质CDK激活的精细模型蛋白质蛋白质由GTP水解引起的EF-TU的构型变化蛋白质蛋白质ATP结合使马达蛋白从构型1滑动到构型2，ATP接着被水解，

24、引起从构型2到构型3的变化。 蛋白质蛋白质Zinc Finger: 2 His (green) and 2 Cys (red) coordinate the Zn+ (blue)蛋白质蛋白质蛋白质蛋白质Helix-turn-helix domain of Helix-turn-helix domain of homeodomainhomeodomain蛋白质蛋白质蛋白质蛋白质蛋白质蛋白质蛋白质蛋白质蛋白质蛋白质6. SH2和和SH3结构域结构域 蛋白质蛋白质四、生物大分子相互作用和复杂聚集物的结构四、生物大分子相互作用和复杂聚集物的结构 1、 一种多蛋白装配体一种多蛋白装配体胶原蛋白胶原蛋白

25、原胶原细丝原胶原细丝(procollagen filaments) (04nm) 原小纤维原小纤维 (protofibrils) (1115nm) 微小纤维微小纤维 (microfibrils) (30200nm) 胶原蛋白小纤维胶原蛋白小纤维(collagen fibrils) (0.20.4m) 纤维纤维(fibers) (fibers) (110m) 腱、骨胳、软骨等腱、骨胳、软骨等( (肉眼可见肉眼可见) )蛋白质蛋白质蛋白质蛋白质 （a）胶原纤维的分子结构与形成过程胶原纤维的分子结构与形成过程()；（b）胶原纤维的电镜照片胶原纤维的电镜照片 蛋白质蛋白质胶原纤维中原胶原蛋白分子的排列胶原纤维中原胶原蛋白分子的排列 蛋白质蛋白质蛋白质蛋白质 DNA双螺旋 1/7 螺旋化(H2A，H2B，H3，H4) 核小体 1/6 螺旋化(H1) 螺线管 1/30 折叠和螺旋化 超螺线环 1/5 折叠和螺旋化 合计1/6 300 染色单体 DNA压缩比率 压缩方法 蛋白质蛋白质蛋白质蛋白质DNA上与Cro蛋白结合的17个碱基的顺序 Cro蛋白的排列 Cro蛋白蛋白OR3复合物的推测结构复合物的推测结构 蛋白质蛋白质流动镶嵌模型流动镶嵌模型 烟草花叶病毒装配的移动环模型烟草花叶病毒装配的移动环模型 蛋白质蛋白质蛋白质蛋白质