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1、一、石蜡油低温保藏法本方法的原理是在长好的斜面菌上覆盖灭菌的液体石蜡，达到菌体与空气隔绝，使菌处于生长和代谢停止状态，同时石蜡油还防止水分蒸发，在低温下达到较长期的保藏菌种的目的。保藏温度要求在-44下。液体石蜡法适用于不产孢子的菌种。具体操作是：菌种为斜面培养菌种，斜面不宜过长；选择纯净优质石蜡油，置三角烧瓶中经过121高压蒸汽灭菌12h，将其放烘箱中(160左右)干热处理，去除灭菌时渗入的水分，待石蜡油变得清澈透明后冷却即可加入斜面，斜面上不能出现气泡，液蜡添加量以高出斜面顶部约1cm为宜。二、甘油管冷冻保藏法1试验方法介绍 本法也是利用微生物在甘油中生长和代谢受到抑制的原理达到保藏目的。
2、其方法是，将80%的甘油高压蒸汽灭菌待用。将培养好的斜面菌种用无菌水制成高浓度的菌悬液(1081010/ml)。取1ml灭菌甘油放入与甘油充分混匀，使甘油浓度约为10%-30%，于-70下冻存。-20保存时间较短。或采用体积比为8：2的甘油生理盐水，加入新鲜培养的菌体肉汤，混合均匀后至-20冰箱保存。2效果 该法适用于一般细菌的保存，同时也适用于链球菌、弧菌、真菌等需特殊方法保存的菌种，适用范围广，操作简便，效果好，无变异现象发生。甘油生理盐水保存液保存菌种优于甘油原液，其原因可能是加入生理盐水适当降低了甘油的高渗作用，且有肉汤培养物适量增加保存液的营养成分，从而更好地保护了待保存的菌株。三、
3、真空冷冻干燥法1试验原理 真空冷冻干燥保藏法是兼具低温、干燥、除氧三方面菌种保藏的主要因素，除不宜于丝状真菌的菌丝体外，对病毒、细菌、放线菌、酵母及丝状菌孢子等各类微生物都适用，不宜用冻干法保存的微生物不到2%。冷冻干燥法是在低温下快速将细胞冻结，然后在真空条件下干燥，使微生物的生长和酶活动停止。为了防止在冷冻和水分升华过程中对细胞的损害，要采用保护剂来制备细胞悬液，使菌在冻结和脱水过程中起到保护作用的溶质，通过氢键和离子键对水和细胞所产生的亲和力来稳定细胞成分的构型。即是使样品中的水分在冰冻状态下，抽真空减压，使冻结的冰直接升华为水蒸气，使样品达到干燥。干燥后的微生物在真空下封装，与空气隔绝
4、，达到长期保藏的目的。2试验步骤1）安瓿管准备 选取规格约直径为8mm，高100mm的中性玻璃安瓿管，先用2%盐酸浸泡810h，再经自来水冲洗多次，用蒸馏水涮洗23次，烘干；在每管内放入打好菌号及日期的标签，字面朝向管壁，管口塞好棉塞，灭菌备用。2）保护剂的选择及制备 冷冻干燥保藏法使用的保护剂种类很多，效果不尽相同，通常采用高分子化合物与低分子化合物混合使用效果更好。在配制时注意比例、浓度、pH和灭菌方法。一些对热敏感的保护剂如血清等用过滤除菌，牛奶、葡萄糖及乳糖等要控制灭菌温度。一般情况下，多数菌种可以用脱脂乳糖等要控制灭菌温度。一般情况下，多数菌种可以用脱乳为保护剂。 3）菌种准备及分装
5、 菌种要求为生长良好的纯种，菌龄以处于稳定期为好，孢子是新鲜的。每支长好的斜面加23ml保护剂，用接种环将菌苔轻轻刮起(注意勿刮起培养基)，制成菌悬液。如用液体培养的菌种，则需经离心收集和用灭菌生理盐水洗涤细胞，收集的菌体用保护剂悬浮制成菌悬液。悬液中菌数要求达到1081010cfu/ml为宜。悬液制备完成尽快分装和冻结。分装安瓿时可用灭菌的长滴入安瓿管底部，装量可依据冷冻干燥机效能而定。 4）预冻 分装好的安瓿管需要进行预冻，即放在-30-40下冻结2060min，也可以用干冰和无水乙醇冻510min。5）冷冻干燥 经预冻的安瓿放入干燥箱中开始抽真空干燥。此时干燥箱温度控制在-30以下，并尽
6、快使真度达到66Pa以下。此后可还渐升温以加速水分升华，但升温不宜过快，以免引起样品融化。干燥时间视冻干机效率、样品装量及性质等而定，以样品最终水分含量达到1%3%为准。具体操作时是根据冻干样品呈酥块工松散片状；真空度接近空载时最高真空；样品温度与管外温度接近。 干燥完毕将安瓿管在真空下用火焰烧熔密封，并用高频真空检测真空度。6）保藏及冻干管的启用 密封好的冻干管在4或-18下保藏。当需用冻干菌种时，取出安瓿管用酒精表面消毒，用小砂轮在无菌条件下打开，或将安瓿顶部在酒精灯火焰上灼烧，迅速滴上冷的无菌水，使管破裂，然后用镊子等轻轻敲碎管口，加入0.30.5ml液体培养基溶解冻干菌块成为悬液，用无
7、菌滴管或接种环移至斜面或液体培养基进行培养。7）影响菌株生长因素 菌的质量：保藏的菌种应培养在营养丰富的最适条件下，使之进入稳定期，稍老一些的菌体对环境抵抗力强。另处，作为冷冻干燥的菌悬液细胞浓度要高不同的菌对冷冻干燥的耐受程度不同，如果保存的菌液细胞浓度不高，就会使以后传种造成困难，保存期也会受到影响。保护剂：不同种类的保护剂对不同微生物的作用是不同的，如个别菌种在脱脂乳作保护剂的情况下死亡率高达99.99%，而采用葡聚糖等混和保护剂时死亡率大大减少。一般情况下，那些容易保存的菌种对保护剂的要求不很严格，而不易保存的菌种对保护剂的要求却很苛刻。因此，选择好的保护剂是冷冻干燥保存菌种的关键因素
8、。干燥速度：实验表明，慢速干燥比快速干燥存活率高，如青霉菌6h干燥存活率为67.3%，而3h为59%。空气的影响：冷冻干燥后空气对细菌细胞影响较大，可导致细胞损伤进而死亡，故在冻干后应立即在真空下融封，才有利于长期保存。 温度的影响 在干燥和真空状况下温度的影响远没有上述几项因素重要，因此可以在室温下保存，但许多微生物在4保存的存活率要比在室温下高1倍。含水量的影响：水分含量过高对菌存活不利，完全脱水也不利于保存，一般把干燥后的细胞含水量控制在3%以下(1%3%)。 复苏培养：打开安瓿管后加入无菌水使 冻干菌融化，融化速度慢比快速融化的成活率要高。菌种能否适宜于冻干保存，需经过实验来证明，一般
9、是在保存1个月进行复苏培养，如果菌的成活率高于10%，即认为可用冻干保存法保存，以后6个月、2年、5年、10年再进行检查存活情况，以确定保存期的上限。冻干保藏的效果因微生物种类而异，一般是细菌放线菌真菌藻类，而菌丝体不宜用此法保存。3试验效果 冷冻干燥保存的菌种存活时间长、效果好，一般菌种可保存5年以上，有的可保藏15年以上不发生变异。还具有体积小、不易污染、便于运输等优点，是一种用得最为广泛的菌种保藏方法。4试验仪器及试剂 冷冻干燥备有不同型号和类型，但都由四个部分组成：干燥箱、蒸汽捕集器、真空泵、冷冻系统。干燥箱可控制温度范围为-4040。四、液氮超低温保存 1试验原理 本方法是近年推广使
10、用的一种菌种保存法。大多数微生物如病毒、噬菌体，立克氏体，各种细菌、放细菌、支原体，各种丝状菌、酵母、藻类和原虫，特别是一些无法用冻干保存的微生物，都可用此法长期保存。工业微生物高产菌种也逐步采用此法保存。液氮保存的原理是微生物在-130以下温度时，它的新陈代谢作用停止，化学反应也消失，而液氮温度可达-196，在这种情况下可以长期保存。 2试验步骤 1)安瓿管准备 一般要求用95%料或GG17的玻管制作，以能承受巨大的温差变化而不破损，大小根据需要而定。用印同在管壁上书写菌号，160烘干，加棉塞灭菌备用。2)菌种准备 在最适培养基斜面上培养得到健壮菌种，制成悬浮液，如为不产孢子的真菌，则采用斜
11、面或液体振荡培养，制成菌丝片段。将菌悬淮分装至灭菌安瓿管中，每管0.20.5ml，然后用火焰将安瓿熔封。3)冻结 将熔封后的安瓿管入大慢速冻结器上，以每分钟下降1的速度冷冻，当安瓿管温度下降至-35时，即可把安瓿管移入液氮内作长期保藏。4)菌种的复苏培养 直至全部溶化为止，当溶化后即开启安瓿移至培养基内培养，扣作时应特别注意安全，防止爆炸或冻伤，不宜戴线手套，要戴皮手套操作3试验仪器及试剂1）保护剂 与冷冻干燥保存一样，液氮保存菌种也需要有保护物质，可以用10%的甘油，使用方便、效果好，但有些菌对甘油敏感，效果不佳，可选用其他保护剂，常用的有5%10%(V/V)二甲基亚砜；20%二甲亚砜加1%蛋白陈；吐温80及0.4mmol聚乙烯氮戊环等，糖类也可作为一种保护剂，但浓度适当加以控制。2）液氮罐
微生物实验菌种保藏方案
