单海丽重组白细胞介素203版课件

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1、2022-6-22单海丽重组白细胞介素203版1学号：姓名：单海丽班级：09级生物工程（4）班2022-6-22单海丽重组白细胞介素203版2 白细胞介素-2（ IL2）是由Morgan和 Ruscetti发现的由T细胞产生的一种淋巴因子，是一个分子质量为14500的糖蛋白。可使细胞毒性T细胞、自然杀伤细胞(N K )和淋巴因子激活的杀伤细胞(LAK)增殖，并升高其杀伤活性，进而清除体内肿瘤细胞和病毒感染细胞等。还可促进干扰素、肿瘤坏死因子等细胞因子的分泌和抗体产生，是一种免疫增强剂，具有抗病毒、抗肿瘤和增强机体免疫功能等作用。2022-6-22单海丽重组白细胞介素203版3免疫作用机理： I

2、L -2 能与任何能形成IL -2 受体的细胞, 如辅助性T 细胞(T H ) 、细胞毒性T 细胞(T e ) 、B 细胞和自然杀伤细胞结合, 但结合的强度以T c 细胞为最高。IL -2 与相应受体结合后, 细胞即从G 相进入S 相并开始分化增殖。2022-6-22单海丽重组白细胞介素203版41. 肿瘤治疗： 在恶性肿瘤的发病机制中, 肿瘤病人的白介素-2 含量较正常的水平低, 不能使NK、CT L、LAK 等杀伤细胞活化和增殖, 使肿瘤细胞逃逸，得不到清除。此时必须提供外源白介素-2, 帮助病人完成免疫监视功能, 这就是白介素-2 治疗肿瘤的免疫学基础。2022-6-22单海丽重组白细胞

3、介素203版52.抗病毒感染3.对感染性疾病的治疗作用4.对其他疾病的治疗：白介素-2 在急性白血病、抗高血压、抗寄生虫、免疫佐剂等方面都有着积极的应用。2022-6-22单海丽重组白细胞介素203版6IL-2一级结构2022-6-22单海丽重组白细胞介素203版7 IL-2为螺旋状的长肽链，由133个氨基酸组成，其中共有三个半胱氨酸（cys)分别在第58、105、125位，其中58位与105位的cys生成的二硫键为活性所必需，且易错配或生成二聚体，降低生物活性。基因工程重组IL-2用点突变的方法把125位的cys改成Ser或Ala，使IL-2分子稳定性增强。如果用点突变的方法把58或105位

4、的cys变成其他氨基酸，则rIL-2的活性几乎完全丧失。2022-6-22单海丽重组白细胞介素203版81.提高白细胞介素2的比活性2.提高白细胞介素2的稳定性： 由于野生型白细胞介素2分子中125位cyt是游离的，易于与58或105位的cyt形成错配的二硫键，或分子间形成二硫键而导致二聚体的形成，不利于白细胞介素2的稳定。125位丝氨酸型白细胞介素2则不存在二硫键错配问题。2022-6-22单海丽重组白细胞介素203版93.易于纯化： 在重组白细胞介素2的纯化过程中，白细胞介素2要被还原剂还原为一级结构，然后再氧化为有活性的白细胞介素2 。由于125位cyt是游离的，易于与58或105位的c

5、yt形成错配的二硫键，或分子间形成二硫键而导致二聚体的形成。这些形成的异构体和二聚体一方面会给纯化工作带来麻烦，另一方面比活性降低。125位cyt被ser或Ala取代的IL-2则不纯在错配问题，因而有利于IL-2的纯化。4.降低毒性： 125位cyt被ser或Ala取代的IL-2由于比活性进一步提高，在给予同等活性的IL-2时，新型IL-2由于蛋白质的绝对数量较少而可能具有较小的毒性，更容易被病人耐受，从而有利于临床治疗的进行。2022-6-22单海丽重组白细胞介素203版10对蛋白进行化学修饰后可以提高其抗酶消化的能力, 延长其在体内的作用时间, 提高药效，降低或消除其在体内的免疫原性。对I

6、L-2 进行修饰的主要为PEG,。 1992 年有人利用N-羟基丁二酰胺活化PEG 修饰r IL-2, 作用时间提高10 倍，而且免疫原性下降, 抗肿瘤性能提高, 毒副作用有所降低。 1994 年和1997 年及其后都有人用PEG 修饰rIL-2 得到生物活性基本不变而抗原性降低的修饰蛋白的报道; 随后白介素-2 的化学修饰研究与其它蛋白的化学修饰一样成为了研究的热点。2022-6-22单海丽重组白细胞介素203版11IL-2 cDNA IL-2 cDNA 文库的构建文库的构建利用探针杂交筛选利用探针杂交筛选IL-2 cDNAIL-2 cDNA阳性克隆阳性克隆与质粒载体与质粒载体pBV220p

7、BV220连接，连接，并转入大肠杆菌并转入大肠杆菌DH5aDH5aIL-2IL-2基因表达基因表达分离纯化包涵体分离纯化包涵体溶解，复性，纯化溶解，复性，纯化纯化的纯化的rIL-2rIL-2T T细胞细胞mRNAmRNA反转录反转录cDNAcDNA2022-6-22单海丽重组白细胞介素203版12一种制备方法：1.构建工程菌：将载有IL-2基因的质粒导入大肠杆菌细胞中，筛选出目的菌。2.挑单菌落接种于装有LB培养基的摇瓶中，在30 振荡培养8-10小时，然后转入含有合成培养基的发酵罐中，30 下培养11-13小时，再在42 下培养5-6小时，发酵后收集菌体。3.包涵体提取：取菌体，用PH8.5

8、，浓度为50mMol Tris.Hcl-1mMol EDTA-1mMol DTT缓冲液洗两遍，沉淀物再悬于同样缓冲液中，加溶菌酶，4 下作用30分钟，冰浴超声至完全破裂为止，离心除去可溶性杂志，沉淀悬于PH8.5浓度为50mMol Tris.Hcl-1mMol EDTA-2mMol DTT。搅拌下缓慢滴加同体积PH8.5，浓度为50mMol Tris.Hcl-1mMol EDTA-8mMol 尿素，室温下缓慢搅拌20-40分钟，离心除去可溶性杂志，沉淀再用缓冲液洗两遍，再将沉淀溶于PH8.5，浓度为50mMol Tris.Hcl-10mMol DTT-7至8Mol GuHCL,溶解1.5小时后

9、离心取上清在4 保存。2022-6-22单海丽重组白细胞介素203版134.（1）凝胶层析：取上清装入sephacrylus-200中，用PH8.5，浓度为 50mMol Tris.Hcl-3至6Mol GuHcl充分平衡后上样，平衡液洗脱，结果出现三个蛋白峰，收集第三峰，4 保存； （2）复性：取凝胶层析后样品，浓度为50mMol Tris.Hcl稀释三倍，加氧化和还原性谷胱甘肽，至1mMol和5-10mMol，调PH使为7-9，室温放置两小时，浓缩至10倍，过sephadex G25柱，用PH3.0，浓度为0.1molGlyHcl平衡并洗脱，收蛋白峰。 （3）高效液相层析：用HPLC仪进行

10、纯化，用0.1%三氟乙酸平衡Cl反相柱后 ，泵入rIL-2样品，进行乙啨梯度洗脱，收集活性峰，低温减压下快速去除乙啨，即可得到rIL-2纯品。2022-6-22单海丽重组白细胞介素203版14通用名：注射用重组人白细胞介素-2英文名：Recombinant Human Interleukin-2 for Injection主要组成成分：重组人白细胞介素-22022-6-22单海丽重组白细胞介素203版15 本品为白色粉末状，易溶于水，溶解后呈透明液体，无肉眼可见不溶物。2022-6-22单海丽重组白细胞介素203版16 本品在体内主要分布于肾脏、肝脏、脾脏和肺。肾脏是主要的代谢器官，肾组织细胞

11、的组织蛋白酶D分解本品，在肾脏、血清中消除半衰期分别为13分和85分钟左右。2022-6-22单海丽重组白细胞介素203版17【功效主治】 用于治疗成人转移性肾细胞癌（RCC）及黑色素瘤等恶性肿瘤，也适用于癌性胸腹水的控制。【化学成分】 主要成份：重组人白细胞介素-2、人血白蛋白。2022-6-22单海丽重组白细胞介素203版18【药理作用】 本品是一种淋巴因子，可使细胞毒性T细胞、自然杀伤细胞和淋巴因子活化的杀伤细胞增殖，并使其杀伤活性增强，还可以促进淋巴细胞分泌抗体和干扰素，具有抗病毒、抗肿瘤和增强机体免疫功能等作用。在对动物的长期毒性试验中证明，无论血象、血尿生化检验、循环系统检查、病理

12、组织学检查，均无异常所见。2022-6-22单海丽重组白细胞介素203版191、用于肾细胞癌、黑色素瘤。乳腺癌、膀胱癌 肝癌、直肠癌、淋巴癌、肺癌等恶性肿瘤的治疗，用于癌性胸腹水的控制，也可以用于淋巴因子激活的杀伤细胞的培养。 2、用于手术、放疗及化疗后的肿瘤患者的治疗，可增强机体免疫功能。 3、用于先天或后天免疫缺陷症的治疗，提高病人细胞免疫功能和抗感染能力。 4、各种自身免疫病的治疗：如类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、干燥综合征等 5、对某些病毒性、杆菌性疾病、胞内寄生菌感染性疾病：如乙型肝炎、麻风病、肺结核、白色念珠菌感染等具有一定的治疗作用。2022-6-22单海丽重组白细胞介素203

13、版20本品应在临床医师指导下使用。 1.静脉滴注：一次用本品10万一80万国际单位(IU)加入到50ml氯化钠注射液中，静脉滴注23小时，一日1次，46周为一疗程。 2.皮下注射：一次用本品50万100万国际单位(IU)用2ml氯化钠注射液溶解，皮下注射，一周23次，6周为一疗程。 3.胸腹腔注射：一次用本品30万l00万国际单位(IU)用20ml氯化钠注射液溶解，胸腔或腹腔注射，尽量抽出腔内积液后注入，一周12次，24周(或积液消失)为一疗程。 4.介入动脉灌注：一次用本品40万l00万国际单位(IU)，用100ml-250l氯化钠注射液溶解， 二周1次，6周为一疗程。 5.肿瘤灶局部给药：

14、根据瘤体大小决定用药剂量。一般剂量为一次20万国际单位(IU)，一周连用4次，2-4周为一疗程。2022-6-22单海丽重组白细胞介素203版21【不良反应】 1 各种不良反应中最常见的是发热、寒战，而且与用药剂量有关，一般 是一过性发热（38左右），亦可有寒战高热，停药后34小时体温 多可自行恢复到正常。个别患者可出现恶心、呕吐、类感冒症状。 2 皮下注射者局部可出现红肿、硬结、疼痛，所有副反应停药后均可自 行恢复。 3 使用较大剂量时，本品可能会引起毛细血管渗漏综合征，表现为低 血压、末梢水肿、暂时性肾功能不全等。使用本品应严格掌握安全量， 出现上述反应可对症治疗。2022-6-22单海丽

15、重组白细胞介素203版22【禁忌症】1 对本品成份有过敏史的病人。2 高热、严重心脏病、低血压者，严重心肾功能不全者，肺功能异常或进行过器官移植者。3 重组人白细胞介素-2即往用药史中出现过与之相关的毒性反应： （1） 持续性室性心动过速；（2） 未控制的心率失常；（3） 胸痛并伴有心电图改变、心绞痛或心肌梗塞；（4） 心压塞；（5） 肾功能衰竭需透析72小时；（6） 昏迷或中毒性精神病48小时；（7） 顽固性或难治性癫痫；（8） 肠局部缺血或穿孔；（9） 消化道出血需外科手术；（10） 孕妇慎用。2022-6-22单海丽重组白细胞介素203版231.徐月美 中国医药工业杂志 19922.李伟

16、 生物技术 19973.新型重组人白细胞介素2的制备方法及其表达载体和工程菌 中华人民共和国国家知识产权局 19994.重组人白细胞介素制备工艺 中华人民共和国国家知识产权局 19935.重组人白细胞介素制备工艺 中华人民共和国国家知识产权局 19946.重组白细胞介素-2 (In te r le u k in -2 )在临床的应用和展望 广州医学院学报 19987.白介素- 2 研究进展 海峡药学 20068.白细胞介素一2 工程菌高效表达影响因素的初探 中国医药工业杂 志 19969.基因工程白介素2 的纯化研究 中国免疫学杂志 19902022-6-22单海丽重组白细胞介素203版24谢谢谢谢! !