重组DNA技术学习教案

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1、会计学1第一页，共60页。个或两个以上个或两个以上DNA分子重新组分子重新组合并在适当细胞中增殖形成新合并在适当细胞中增殖形成新DNA分子的过程。分子的过程。第1页/共60页第二页，共60页。第一节第一节自然界自然界DNADNA重组和基因重组和基因(jyn)(jyn)转移转移DNA Recombination DNA Recombination and Gene Transfer in and Gene Transfer in NatureNature第2页/共60页第三页，共60页。DNA重组重组(zhn z)同源重组同源重组 (homologous recombination)位点特异的重

2、组位点特异的重组(site-specific recombination)转座重组转座重组(transposition recombination)接合作用接合作用 (conjugation)转化转化(zhunhu)作用作用 (transformation)转导作用转导作用 (transduction)第3页/共60页第四页，共60页。发生发生(fshng)在同源序列间的重组称为同源重在同源序列间的重组称为同源重组组(homologous recombination)，又称基本重，又称基本重组（组（general recombination）。是最基本的）。是最基本的DNA重组方式，通过链的断

3、裂和再连接，在重组方式，通过链的断裂和再连接，在两个两个DNA分子同源序列间进行单链或双链片分子同源序列间进行单链或双链片段的交换。段的交换。以以E.coli的同源重组为例，了解同源重组机制的同源重组为例，了解同源重组机制的的Holliday模型模型一、同源一、同源(tn yun)重组是最基本的重组是最基本的DNA重组方式重组方式第4页/共60页第五页，共60页。二、位点特异二、位点特异(ty)重组是发生在特异重组是发生在特异(ty)位点间的位点间的DNA整合整合 位点特异重组位点特异重组(site-specific recombination) 是由整合是由整合(zhn h)酶催化，在两个酶

4、催化，在两个DNA序列的特异位点间发生的整合序列的特异位点间发生的整合(zhn h)。第5页/共60页第六页，共60页。三、转座重组三、转座重组(zhn z)可使可使基因移位基因移位由插入序列和转座子介导的基因移位由插入序列和转座子介导的基因移位(y wi)或或重排称为转座重排称为转座(transposition)。大多数基因在基因组内的位置是固定的，大多数基因在基因组内的位置是固定的，但有些基因可以但有些基因可以(ky)(ky)从一个位置移动到从一个位置移动到另一位置。这些可移动的另一位置。这些可移动的DNADNA序列包括序列包括插入序列和转座子。插入序列和转座子。 第6页/共60页第七页，

5、共60页。四、原核细胞可通过四、原核细胞可通过(tnggu)接合、接合、转化和转导进行基因转移或重组转化和转导进行基因转移或重组（一）接合（一）接合(jih)作作用用当细胞与细胞、或细菌通过菌毛相互接触当细胞与细胞、或细菌通过菌毛相互接触时，质粒时，质粒DNA从一个细胞（细菌）转移至另一从一个细胞（细菌）转移至另一细胞（细菌）的细胞（细菌）的DNA转移称为转移称为(chn wi)接合接合作用作用(conjugation)。第7页/共60页第八页，共60页。 可接合可接合(jih)质粒如质粒如 F 因子因子(F factor) 细菌染色体外的小型细菌染色体外的小型(xioxng)环状双链环状双链

6、DNA分分子。子。 质粒质粒第8页/共60页第九页，共60页。（二）转化（二）转化(zhunhu)作用作用通过自动获取或人为地供给外通过自动获取或人为地供给外源源DNA，使细胞或培养的受体细胞获，使细胞或培养的受体细胞获得 新 的 遗 传 表 型 ， 称 为 转 化得 新 的 遗 传 表 型 ， 称 为 转 化(zhunhu)作用作用 (transformation)。第9页/共60页第十页，共60页。例：溶菌时，裂解的例：溶菌时，裂解的DNA片段片段(pin dun)被另一被另一细菌摄取。细菌摄取。第10页/共60页第十一页，共60页。（三）转导（三）转导(zhun do)作用作用当病毒从被

7、感染的（供体）细胞释放出来、当病毒从被感染的（供体）细胞释放出来、再次感染另一（供体）细胞时，发生再次感染另一（供体）细胞时，发生(fshng)在在供体细胞与受体细胞之间的供体细胞与受体细胞之间的DNA转移及基因重组转移及基因重组即为转导作用即为转导作用(transduction)。第11页/共60页第十二页，共60页。噬菌体的生活史噬菌体的生活史溶菌生长溶菌生长(shngzhng)途径途径 (lysis pathway)溶源菌生长溶源菌生长(shngzhng)途径途径 (lysogenic pathway)第12页/共60页第十三页，共60页。第二节第二节 重组重组(zhn z)DNA技术技

8、术Recombinant DNA Technology第13页/共60页第十四页，共60页。重组重组DNA技术相关技术相关(xinggun)概概念念 克隆克隆(k ln)(clone):来自同一始祖的相同副本或来自同一始祖的相同副本或拷贝的集合。拷贝的集合。 获取同一拷贝获取同一拷贝(kobi)的过程称为克隆化的过程称为克隆化(cloning)，即无性繁殖。，即无性繁殖。第14页/共60页第十五页，共60页。技术水平：分子技术水平：分子(fnz)克隆克隆(molecular cloning) （即（即DNA 克隆）克隆） 细胞克隆细胞克隆 个体克隆（动物或植物）个体克隆（动物或植物）第15页/

9、共60页第十六页，共60页。其主要过程包括：在体外将目的其主要过程包括：在体外将目的DNA片段与能片段与能自主自主(zzh)复制的遗传元件（又叫载体）连接，形成复制的遗传元件（又叫载体）连接，形成重组重组DNA分子，进而在受体细胞中复制、扩增，从而分子，进而在受体细胞中复制、扩增，从而获得单一获得单一DNA分子的大量拷贝。分子的大量拷贝。 重组重组DNA技术，又称分子克隆技术，又称分子克隆(k ln)（molecular cloning）或）或DNA克隆克隆(k ln)（DNA cloning）或基因工程（）或基因工程（genetic engineering）技术）技术第16页/共60页第十七

10、页，共60页。第17页/共60页第十八页，共60页。重组重组(zhn z)DNA技术中常用的工具酶技术中常用的工具酶工工 具具 酶酶功功 能能限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶识别特异序列，切割识别特异序列，切割DNADNA连接酶连接酶催化催化DNA中相邻的中相邻的5 磷酸基和磷酸基和3 羟基末端之间形成磷酸羟基末端之间形成磷酸二酯键，使二酯键，使DNA切口封合或使两个切口封合或使两个DNA分子或片段连接分子或片段连接DNA聚合酶聚合酶合成双链合成双链cDNA分子或片段连接；分子或片段连接；缺口平移制作高比缺口平移制作高比活探针；活探针； DNA序列分析；序列分析；填补填补3 末端末端Kleno

11、w片段片段又名又名DNA聚合酶聚合酶I大片段，具有完整大片段，具有完整DNA聚合酶聚合酶I的的53 聚合、聚合、35 外切活性，而无外切活性，而无53 外切活性。常用于外切活性。常用于cDNA第二链合成，双链第二链合成，双链DNA 3 末端标记等末端标记等反转录酶反转录酶合成合成cDNA；替代替代DNA聚合酶聚合酶I进行填补，标记或进行填补，标记或DNA序列分析序列分析多聚核苷酸激酶多聚核苷酸激酶催化多聚核苷酸催化多聚核苷酸5 羟基末端磷酸化，或标记探针羟基末端磷酸化，或标记探针末端转移酶末端转移酶在在3 羟基末端进行同质多聚物加尾羟基末端进行同质多聚物加尾碱性磷酸酶碱性磷酸酶切除末端磷酸基切

12、除末端磷酸基第18页/共60页第十九页，共60页。限制性核酸限制性核酸(h sun)内切酶内切酶(restriction endonuclease) 限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶(restriction endonuclease, RE)是一类是一类(y li)核酸内切酶，能识别双链核酸内切酶，能识别双链DNA分子内部的特异序列分子内部的特异序列, 并裂解磷酸二酯键。并裂解磷酸二酯键。GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCC GBam H定义定义(dngy)：第19页/共60页第二十页，共60页。与甲基化酶共同与甲基化酶共同(gngtng)构成细菌的构成细菌的限制修饰系统，限制外源限

13、制修饰系统，限制外源DNA，保护自身，保护自身DNA。、（基因工程（基因工程(jyn gngchng)技术中常用技术中常用型）型）分类分类(fn li)：作用：作用：第20页/共60页第二十一页，共60页。第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写；第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写；第二第二(d r)、第三个字母是该细菌的种名，用小写；、第三个字母是该细菌的种名，用小写；第四个字母代表株；第四个字母代表株；用罗马数字表示发现的先后次序。用罗马数字表示发现的先后次序。命名命名(mng mng)：Hin d 属属 系系 株株 序序Haemophilus influenzae d株株流感流感(

14、li n)嗜血杆菌嗜血杆菌d株的第三种酶株的第三种酶第21页/共60页第二十二页，共60页。类酶识别类酶识别(shbi)(shbi)序列特点序列特点 回文结构回文结构(palindrome) (palindrome) 切口切口(qi ku) (qi ku) ：平端切口：平端切口(qi ku)(qi ku)、粘端切口、粘端切口(qi ku)(qi ku)第22页/共60页第二十三页，共60页。Bam HGTCCAGGCCTAGGATCC GGGATCCCCTAGGHindGTCGACCAGCTGGACCTG平端切口平端切口(qi ku)(qi ku)黏端切口黏端切口(qi ku)第23页/共60

15、页第二十四页，共60页。有些限制性内切酶虽然识别序列不完全相同，有些限制性内切酶虽然识别序列不完全相同，但切割但切割DNA后，产生相同的粘性后，产生相同的粘性(zhn xn)末端，末端，称为同尾酶。这两个相同的粘性称为同尾酶。这两个相同的粘性(zhn xn)末端称末端称为配伍末端为配伍末端(compatible end)。 GGATCC CCTAGG AGATCT TCTAGAGCCTAG GATCC GATCTAG GATCT A 同尾酶同尾酶第24页/共60页第二十五页，共60页。来源来源(liyun)(liyun)不同的限制酶，但能识别不同的限制酶，但能识别和切割同一位点，这些酶称同裂酶

16、或同功异和切割同一位点，这些酶称同裂酶或同功异源酶。源酶。GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCC GBam HGGATCCCCTAGGGCCTAGGATCC GBst同裂酶：同裂酶：第25页/共60页第二十六页，共60页。 二、重组二、重组DNADNA技术中常用技术中常用(chn (chn yn)yn)的载体的载体 定义定义为携带目的基因，实现其无性繁殖或表达为携带目的基因，实现其无性繁殖或表达有意义的蛋白质所采用的一些有意义的蛋白质所采用的一些(yxi)DNA分分子。子。 载体按功能载体按功能(gngnng)分为分为 克隆载体克隆载体(cloning vector) 表达载体表达载体

17、(expression vector) 第26页/共60页第二十七页，共60页。克隆载体克隆载体(cloning vector)为使插入的外源为使插入的外源DNA序列被扩增而特意设计序列被扩增而特意设计(shj)的载体称为克隆载体。的载体称为克隆载体。 表达载体表达载体(zit)(expression vector) 为使插入的外源为使插入的外源DNA序列可转录翻译成序列可转录翻译成 多肽链多肽链而特意设计的载体而特意设计的载体(zit)称为表达载体称为表达载体(zit)。第27页/共60页第二十八页，共60页。（一）克隆（一）克隆(k ln)载体载体1. 1. 克隆载体应具备克隆载体应具备(

18、jbi)(jbi)的的基本特点基本特点 第28页/共60页第二十九页，共60页。（1 1）质粒）质粒 (plasmid)特点特点: : 能在宿主细胞能在宿主细胞(xbo)(xbo)内独立自主复制；带有某些遗内独立自主复制；带有某些遗传信息传信息, , 会赋予宿主细胞会赋予宿主细胞(xbo)(xbo)一些遗传性状。一些遗传性状。 2. 常用常用(chn yn)的克隆载体的克隆载体 第29页/共60页第三十页，共60页。第30页/共60页第三十一页，共60页。 噬菌体噬菌体DNA改造系统改造系统 gt系列（插入系列（插入(ch r)型，适用型，适用cDNA克隆）克隆） EMBL系列（置换型，适用基

19、因组克隆）系列（置换型，适用基因组克隆）（2 2）噬菌体）噬菌体(phage) M13噬菌体噬菌体DNA改造系统（含改造系统（含lacZ基因基因(jyn)） M13mp系列系列 pUC系列系列第31页/共60页第三十二页，共60页。 柯斯质粒（柯斯质粒（cosmid）载体（又称黏粒载体）载体（又称黏粒载体） 酵母人工染色体酵母人工染色体 (yeast artificial chromosome, YAC) 细菌人工染色体细菌人工染色体 (bacterial artificial chromosome, BAC) 动物动物(dngw)病毒病毒DNA改造的载体改造的载体 （如腺病毒，腺病毒相关病毒

20、，逆转录病毒）（如腺病毒，腺病毒相关病毒，逆转录病毒）（3）其他克隆）其他克隆(k ln)载载体体第32页/共60页第三十三页，共60页。第33页/共60页第三十四页，共60页。 原核表达原核表达(biod)载体的基本组成载体的基本组成 R R：调节：调节(tioji)(tioji)序列；序列；P P：启动子；：启动子；SDSD：SDSD序列；序列；TTTT：转录终止序列：转录终止序列第34页/共60页第三十五页，共60页。 真核表达载体真核表达载体(zit)的基本组成的基本组成 OriPro：原核复制起始序列；P：启动子；MCS：多克隆位点； TT：转录(zhun l)终止序列；orieuk

21、：真核复制起始序列。第35页/共60页第三十六页，共60页。第三节第三节重组重组(zhn z)DNA技术技术基本原理基本原理和操作步骤和操作步骤第36页/共60页第三十七页，共60页。基本原理基本原理目的基因的获取目的基因的获取DNA导入受体细胞导入受体细胞外源基因与载体的连接外源基因与载体的连接克隆载体的选择和构建克隆载体的选择和构建重组体的筛选重组体的筛选克隆基因的表达克隆基因的表达 第37页/共60页第三十八页，共60页。 以以 质质 粒粒 为为 载载 体体 的的DNA 克克 隆隆 过过 程程第38页/共60页第三十九页，共60页。第39页/共60页第四十页，共60页。组织组织(zzh)

22、或细胞染色体或细胞染色体DNA基因基因(jyn)片断片断克隆克隆(k ln)载体载体重组重组DNA分子分子含重组分子的转化菌含重组分子的转化菌限制性内切酶限制性内切酶受体菌受体菌基因组基因组DNA文库文库存在于转化细胞存在于转化细胞内由克隆载体所携带的内由克隆载体所携带的所有基因组所有基因组DNA的集合的集合 从基因组从基因组DNA文文库获取目的基因库获取目的基因第40页/共60页第四十一页，共60页。mRNA cDNA 双链双链cDNA 重组重组DNA分子分子 cDNA文库文库 反转录酶反转录酶 载体载体 受体菌受体菌 复复制制 从从cDNA文库文库(wnk)获取目的基因获取目的基因 逆转录

23、酶逆转录酶A A A A T T T T AAAASISI核酸酶核酸酶 DNA聚合酶聚合酶碱水解碱水解 T T T T第41页/共60页第四十二页，共60页。（二）载体（二）载体(zit)(zit)的选择与构建的选择与构建选选目的不同，操作基因的性质不同，载体的目的不同，操作基因的性质不同，载体的选择和改建选择和改建(gijin)(gijin)方法也不同。方法也不同。 目的：目的： 获得某一目的基因或获得某一目的基因或DNA片段片段(pin dun) 获得目的获得目的DNA片段片段(pin dun)所编码的蛋白质所编码的蛋白质第42页/共60页第四十三页，共60页。载体载体插入插入DNA片段片

24、段宿主细胞宿主细胞质粒质粒510kb细菌，酵母细菌，酵母噬菌体载体噬菌体载体20kb细菌细菌黏粒黏粒50 kb细菌细菌BAC400kb细菌细菌YAC3 Mb酵母酵母不同载体的克隆不同载体的克隆(k ln)(k ln)容量及适宜宿主细胞容量及适宜宿主细胞 第43页/共60页第四十四页，共60页。（三）目的（三）目的(md)DNA与载体连接与载体连接接接方式：（方式：（1）单一相同黏端连接）单一相同黏端连接(linji) （2）不同黏端连接）不同黏端连接(linji) （3）通过其他措施产生黏端进行连接）通过其他措施产生黏端进行连接(linji) 1. 黏端连接黏端连接(linji)第44页/共6

25、0页第四十五页，共60页。Bam H切割切割(qig)反应反应 GGATCC CCTAGGT4 DNA连接酶连接酶15CGATCC GGCCTAG目的基因用目的基因用 Bam H切割切割GCCTAGGCCTAGGCCTAGGCCTAGGATCCGGATCCGGATCCGGATCCG载体载体DNA用用Bam H切割切割GCCTAGGCCTAGGCCTAGGCCTAGGATCCGGATCCGGATCCGGATCCG重组体重组体GCCTAGGCCTAGGATCCGGATCCGGCCTAGGCCTAGGATCCGGATCCG载体自连载体自连目的基因自连目的基因自连单一单一(dny)相同黏端连接相同黏端

26、连接第45页/共60页第四十六页，共60页。不同不同(b tn)黏端连接（定向克隆）黏端连接（定向克隆）GCTTAAATCTAGAATTCGGATCTAGAATTCCTTAAGAGATCTTCTAGAEco R切割位点切割位点Bg l切割位点切割位点AATTCGATCTAGAATTCGGATCTAAATTCGATCTAGEcoR+ Bg l双酶切双酶切Eco R+ Bg l双酶切双酶切GCTTAAATCTAGAATTCGGATCTAT4 DNA连接酶连接酶15C重组体重组体第46页/共60页第四十七页，共60页。2. 平端连接平端连接(linji) 限制性内切酶切割限制性内切酶切割(qig)产

27、生的平产生的平端端粘端补齐或切平形成的平端粘端补齐或切平形成的平端适用适用(shyng)于：于：第47页/共60页第四十八页，共60页。目的基因目的基因载体载体限制性内切酶限制性内切酶限制性内切酶限制性内切酶T4 DNA连接酶连接酶15C重组体重组体载体自连载体自连目的基因目的基因 自连自连第48页/共60页第四十九页，共60页。受体菌条件：受体菌条件：安全宿主安全宿主(szh)菌菌 限制酶和重组酶缺陷限制酶和重组酶缺陷处于感受态处于感受态(competent) 导入方式：导入方式：转化转化(zhunhu) (transformation)转染转染 (transfection)感染感染 (in

28、fection)（四）重组（四）重组(zhn z)DNA转入受体细胞转入受体细胞转转第49页/共60页第五十页，共60页。1. 借助载体上的遗传标志进行筛选借助载体上的遗传标志进行筛选 (1) 利用抗生素抗性标志筛选利用抗生素抗性标志筛选(2) 利用基因的插入失活利用基因的插入失活/插入表达插入表达(biod) 特性筛选特性筛选(3) 利用标志补救筛选利用标志补救筛选(4)利用噬菌体的包装特性进行筛选利用噬菌体的包装特性进行筛选（五）重组体的筛选（五）重组体的筛选(shixun)与鉴定与鉴定筛筛第50页/共60页第五十一页，共60页。2. 序列序列(xli)特异性筛选特异性筛选 (1) RE酶

29、切法酶切法(2) PCR法法 (3) 核酸杂交法核酸杂交法(4) DNA测序法测序法 3. 亲和筛选法亲和筛选法第51页/共60页第五十二页，共60页。插入失活筛选插入失活筛选(shixun)(shixun)带有重组载体的克隆带有重组载体的克隆 第52页/共60页第五十三页，共60页。 互补互补(h b)(h b)筛选（蓝筛选（蓝- -白筛选）白筛选） 第53页/共60页第五十四页，共60页。菌落或噬斑原位杂交筛选菌落或噬斑原位杂交筛选(shixun)(shixun)重组体重组体 第54页/共60页第五十五页，共60页。重组重组(zhn z)DNA(zhn z)DNA技术操作过程可形象归技术操

30、作过程可形象归纳为：纳为： 小结小结(xioji)(xioji)分分分离获取目的基因分离获取目的基因 选选载体的选择与构建载体的选择与构建接接目的目的DNADNA与载体连接与载体连接 转转重组重组DNADNA转入受体细胞转入受体细胞筛筛重组体的筛选与鉴定重组体的筛选与鉴定第55页/共60页第五十六页，共60页。重组重组DNA技术操作技术操作(cozu)的主要的主要步骤步骤载体载体质粒质粒噬菌体噬菌体病毒病毒目的基因（外源基因）目的基因（外源基因）基因组基因组DNA cDNA 人工合成人工合成PCR产物产物限制酶消化限制酶消化开环载体开环载体DNA目的基目的基因因连接酶连接酶重组体重组体转化转化

31、体外包装，转染体外包装，转染带重组体的宿主带重组体的宿主筛选筛选表型筛选表型筛选酶切电泳鉴定酶切电泳鉴定菌落原位杂交菌落原位杂交第56页/共60页第五十七页，共60页。表达体系的建立：表达体系的建立： 表达载体表达载体(zit)的构建的构建 受体细胞的建立受体细胞的建立 表达产物的分离纯化表达产物的分离纯化（六）克隆基因（六）克隆基因(jyn)的表的表达达第57页/共60页第五十八页，共60页。 标准：选择标志标准：选择标志 强启动子强启动子 翻译调控序列翻译调控序列多接头克隆位点多接头克隆位点 E.coli表达体系的不足：表达体系的不足：不宜不宜(by)表达真核基因组表达真核基因组DNA；不

32、能加工表达的真核蛋白质；不能加工表达的真核蛋白质；表达的蛋白质常形成不溶性包涵体表达的蛋白质常形成不溶性包涵体(inclusion body) ；很难表达大量可溶性蛋白。很难表达大量可溶性蛋白。1. 原核原核(yun h)表达体系表达体系 (E.coli表达体系最为常表达体系最为常用用)第58页/共60页第五十九页，共60页。 优点：可表达克隆的优点：可表达克隆的cDNA及真核基因组及真核基因组DNA 可适当修饰可适当修饰(xish)表达的蛋白质表达的蛋白质 表达产物分区域积累表达产物分区域积累 缺点：操作技术难、费时、经济缺点：操作技术难、费时、经济 转染转染 将表达载体将表达载体(zit)导入真核细胞的过程导入真核细胞的过程方法方法(fngf)：磷酸钙转染：磷酸钙转染 DEAE葡聚糖介导转染葡聚糖介导转染 电穿孔电穿孔 脂质体转染脂质体转染 显微注射显微注射 2.2.真核表达体系（酵母、昆虫、乳类动物细胞）真核表达体系（酵母、昆虫、乳类动物细胞）第59页/共60页第六十页，共60页。