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1、1第十章第十章 单基因病致病基因的鉴定单基因病致病基因的鉴定2本章主要内容本章主要内容: :o功能克隆功能克隆o定位克隆定位克隆o基于高通量测序技术的致基于高通量测序技术的致病基因的鉴定病基因的鉴定3功能克隆：功能克隆：从蛋白质着手进行基因克隆的策略。从蛋白质着手进行基因克隆的策略。定位克隆定位克隆：在蛋白质产物未知的情况下进行基因克隆的在蛋白质产物未知的情况下进行基因克隆的策略。策略。蛋白蛋白酶消化、分离酶消化、分离氨基酸序列测定氨基酸序列测定设计合成寡核苷酸设计合成寡核苷酸筛选筛选cDNAcDNA文库文库不同多肽片段不同多肽片段家系资料家系资料连锁分析连锁分析获得差异片段获得差异片段染色体
2、异常染色体异常筛选筛选cDNAcDNA文库文库 克隆全长基因克隆全长基因精细定位精细定位消减克隆消减克隆第一节第一节 功能克隆功能克隆4o 通过基因的功能（编码蛋白）而不依赖定位的信息来分离基因的策略o 第一个疾病致病基因通过此策略发现o 范例：镰状细胞贫血的-珠蛋白基因 苯丙酮尿症的苯丙氨酸羟化酶基因流程示意图56甲甲 型型 血血 友友 病病遗传方式：遗传方式：XRXR发病率：发病率：1/10,0001/10,000（男）（男）病因：病因：FF基因遗传性缺陷基因遗传性缺陷 ( (缺失、点突变、插入、重复、倒位缺失、点突变、插入、重复、倒位) ) 基因定位：基因定位：Xq28Xq28 基因全长
3、基因全长186kb186kb，含，含2626个外显子个外显子 临床表现：外伤后出血不止，关节血肿临床表现：外伤后出血不止，关节血肿7 F F因子基因的功能克隆因子基因的功能克隆功能克隆是从功能克隆是从蛋白质蛋白质着手进行基因克隆的策略。着手进行基因克隆的策略。因子因子 多肽多肽 不同多肽片段不同多肽片段蛋白酶消化蛋白酶消化分离分离氨基酸序列测定氨基酸序列测定设计合成寡核苷酸设计合成寡核苷酸筛选筛选cDNA文库文库8通过动物模型鉴定疾病基因通过动物模型鉴定疾病基因910第二节第二节 定位克隆定位克隆11o 基于染色体异常的基因定位o 连锁分析o 确定致病基因12基于染色体异常的基因定位基于染色体
4、异常的基因定位13连锁分析连锁分析14确定致病基因确定致病基因o突变筛查：在家系中该突变与表型共分离是最主要的证据o表型拯救：有些导致疾病的突变通常引起基因功能的丧失，而且其表型是可逆的。如果从一个患者的细胞中能够发现基因突变的表型，我们就可以检测转染了候选基因野生型等位基因的表达载体是否能够“拯救”突变并恢复正常的表型o建立疾病的小鼠模型：如果能够在某一家系中确定一个致病基因，但又无法利用更多的无关患者来验证，通过构建小鼠模型来验证。对于功能丧失性突变导致的表型可以通过制作基因敲除（knock-out）小鼠。对于功能获得性突变导致的表型或者突变效应不清楚的表型，可以制作突变基因敲入（knoc
5、k-in）模型1516Duchenne型肌营养不良型肌营养不良（ Duchenne muscular dystrophy, DMD）n遗传方式：遗传方式： XRn发病率：发病率：1/3400（男）（男）n临床表现：双下肢临床表现：双下肢肌无力、肌无力、Gower征、腓肠肌征、腓肠肌假性肥大、进行性肌萎缩（一般假性肥大、进行性肌萎缩（一般20岁）。岁）。n病 因 ：病 因 ： DMD基 因 突 变 ，基 因 突 变 ， 抗 肌 萎 缩 蛋 白抗 肌 萎 缩 蛋 白（dystrophin）。n基因定位：基因定位：Xp21.23，全长，全长2,400kb，含，含79个外个外显子，是已知最大的致病基因
6、。显子，是已知最大的致病基因。17Gower综合征综合征18 DMD DMD基因的定位克隆基因的定位克隆定位克隆是在定位克隆是在蛋白质产物蛋白质产物未知的情况下进行基因克隆的策略。未知的情况下进行基因克隆的策略。家系资料家系资料 精细定位精细定位 消减克隆消减克隆连锁分析连锁分析获得差异片段获得差异片段染色体异常染色体异常筛选筛选cDNA文库文库克隆全长克隆全长第三节第三节基于高通量测序技术的基于高通量测序技术的致病基因的鉴定致病基因的鉴定19o 2005年问世的高通量测序技术是测序技术发展历程的一个里程碑，使得疾病的研究策略发生了重大转变。o 高通量测序技术的突出优势是测序速度快和测序成本大幅度降低。NGSNGS技术策略技术策略o 全基因组测序o 全外显子组测序o 目标区域测序o 疾病相关基因平行测序20NGSNGS技术在单基因遗传病致病基因鉴定中的策略技术在单基因遗传病致病基因鉴定中的策略o 基于序列捕获技术，研究者可以在全基因组筛选的基础上对特定区域进行更深层次的研究o 由于目标区域缩小，在获得足量目标区域基因变异信息的前提下，样品的测序成本也会大幅降低21单基因病家系致病基因鉴定单基因病家系致病基因鉴定22单基因病散发病例致病基因鉴定单基因病散发病例致病基因鉴定2324
医学遗传学：第十章 单基因病致病基因的鉴定
