分子杂交技术——4组

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1、分子杂交技术摘要：70 年代末期到80 年代早期，分子生物学技术有了突破性进展，限制性内切酶的发展 和应用使分子克隆成为可能。各种载体系统的诞生，尤其是质粒和噬菌体DAN载体的构建， 使特异性DNA探针的来源变得十分丰富。人们可以从基因组DNA文库和cDNA文库中获 得特定基因克隆，只需培养细菌，便可提取大量的探针DNA。关键词：分子杂交碱基对DNA单链双链不同的DNA片段之间，DNA片段与RNA片段之间，如果彼此间的核苷酸排列顺序 互补也可以复性，形成新的双螺旋结构。这种按照互补碱基配对而使不完全互补的两条多核 苷酸相互结合的过程称为分子杂交。分子杂交发展历程通过碱基对之间非共价键的形成即出

2、现稳定的双链区，这是核酸分子杂交的基础。使单 链聚合双链的过程称为退火或复性。核酸杂交技术基本上是Hall等1961年的工作开始的， 探针与靶序列在溶液中杂交，通过平衡密度梯度离心分离杂交体。该法很慢、费力且不精确， 但它开拓了核酸杂交技术的研究。Bolton等1962年设计了第一种简单的固相杂交方法，称 为DNA-琼脂技术。变性DNA固定在琼脂中，DNA不能复性，但能与其它互补核酸序列杂 交。典型的反应是用放射性标记的短DAN或RNA分子与胶中DNA杂交过夜，然后将胶置 于柱中进行漂洗，去除游离探针，在高温、低盐条件下将结合的探针洗脱，洗脱液的放射性 与结合的探针量呈正比。该法尤其适用于过量

3、探针的饱和杂交实验。60年代中期Nygaard 等的研究为应用标记DNA或RNA探针检测固定在硝酸纤维素（NC）膜上的DNA序列奠 定了基础。60年代末，Britten等设计了另一种分析细胞基因组的方法。70年代末期到80 年代早期，分子生物学技术有了突破性进展，限制性内切酶的发展和应用使分子克隆成为可 能。各种载体系统的诞生，尤其是质粒和噬菌体DAN载体的构建，使特异性DNA探针的 来源变得十分丰富。人们可以从基因组DNA文库和cDNA文库中获得特定基因克隆，只需 培养细菌，便可提取大量的探针DNA。迄今为止，已克隆和定性了许多特异DNA探针。 只是取得了上述重大进展，但分子杂交技术在临床实

4、用中仍存在不少问题，必须提高检测单 拷贝基因的敏感性，用非放射性物质代替放射性同位素标记探针以及简化实验操作和缩短杂 交时间，这样，就需要在以下三方面着手研究：第一，完善非放射性标记探针；第二，靶序 列和探针的扩增以及信号的放大；第三，发展简单的杂交方式，只有这样，才能使DNA探 针实验做到简便、快速、低廉和安全。实验原理分子杂交是通过配对碱基对之间的非共价键（主要是氢键）结合，从而形成稳定的双链 区。杂交分子的形成并不要求两条单链的碱基顺序完全互补，所以不同来源的核酸单链只要 彼此之间有一定程度的互补顺序（即某种程度的同源性）就可以形成杂交双链。分子杂交可 在DNA与DNA、RNA与RNA或

5、RNA与DNA的二条单链之间进行。由于DNA 一般都以 双链形式存在，因此在进行分子杂交时，应先将双链DNA分子解聚成为单链，这一过程称 为变性，一般通过加热或提高pH值来实现。用分子杂交进行定性或定量分析的最有效方法 是将一种核酸单链用同位素或非同位素标记成为探针，再与另一种核酸单链进行分子杂交。 杂交技术应用分子杂交（m olecular hybridization ）不同来源的核酸单链之间或蛋白质亚基之间由于结 构互补而发生的非共价键的结合。根据这一原理发展起来的各种技术统称为分子杂交技术， 核酸分子杂交技术是分子遗传学中的重要研究方法。作为探针的已知DNA或RNA片段一般为3050核苷

6、酸长，可用化学方法合成或者直 接利用从特定细胞中提取的mRNA。探针必须预先标记以便检出杂交分子。标记方法有多 种，常用的为同位素标记法和生物素标记法。杂交方法又可分为液相杂交和固相杂交。使单链DNA或RNA分子与具有互补碱基的另一 DNA或RNA片断结合成双链的技 术。即核酸分子间的杂交。相互杂交的两种核酸分子间有时并非完全一致，但必有一定的相 关性。早在1961年有人创建了 DNA与RNA间的分子杂交，但至70年代才发展成基因分 析中一种重要的分析技术，可鉴定基因的特异性。例如可将具有一定已知顺序的某基因的 DNA片段，标上放射性核素，构成核酸探针，将它通过分子杂交与缺陷的基因结合，产生

7、杂交信号，从而把缺陷的基因显示出来，借此可对许多遗传性疾病进行产前诊断。现又用核 酸分子杂交技术诊断乙型肝炎，以及研究其他病毒性疾病和癌瘤的基因结构（癌基因）等。原位（分子）杂交是固相杂交的另一种形式，杂交中的一种DNA处在未经抽提的染色 体上，并在原来位置上被变性成单链，再和探针进行分子杂交。在原位杂交中所使用的探针 必须用比活性高的同位素标记。杂交的结果可用放射自显影来显示，出现银粒的地方就是与 探针互补的顺序所在的位置。基因定位，是对固定在细胞学制片上的染色体DNA进行原位杂交，将与探针互补的顺 序精确地定位到染色体的一定位置上。在基因定位工作中，还可以应用一种在电镜下直接观 察杂种分子

8、的原位杂交方法，即所谓的R-环法。R-环是在双链DNA分子部分变性的情况下， 单链的RNA分子和相应的DNA序列中的一条互补的单链形成RNA-DNA的杂合双链，同 时DNA的另一条单链向外突出而形成的环状图象。由于每种mRNA由特定的基因所转录， 和这一基因的一个DNA单链具有互补结构，因此通过观察标记mRNA参与构成的R环的 位置就可以对产生这种mRNA的基因进行定位，这一方法还可以用来研究断裂基因的结构。 在重组DNA技术中，有些专门的原位杂交方法可以用来筛选有探针顺序的重组质粒或噬菌 体。此外，分子杂交方法还可以用来分离具有特定顺序的核酸分子。例如使探针与细胞的总 DNA进行分子杂交，利

9、用羟基磷灰石柱只吸附双链分子的特性，可以分离与探针互补的 DNA片段或RNA分子。蛋白质分子杂交来自不同的蛋白质的亚基间也可以形成非共价键的结合,这是蛋白质分 子杂交的基础。蛋白质分子杂交技术可以用来研究蛋白质的结构和功能以及相似的蛋白质（如同工酶、血红蛋白等）的亲缘关系。例如通过人、狗、兔、驴、小鼠和蛙等动物的血红 蛋白的蛋白质分子杂交测验，根据能否形成杂种分子和杂种分子的量，可以判断它们的蛋白 质分子的相似程度。从上可见，不管是对哪种杂交技术的研究，其过程都是不易的，但同时也可看出一旦研 究出来，那么其在医学及临床上的影响都是很重大的。总的说来，分子杂交技术是一门会对人类贡献不凡的一门科学。