基因操作实用学习教案

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1、会计学1基因操作基因操作(cozu)实用实用第一页，共64页。粘性末端连接、平末端连接、粘性末端连接、平末端连接、人工人工(rngng)(rngng)接头连接法，同聚物加尾连接。接头连接法，同聚物加尾连接。第1页/共63页第二页，共64页。1 1 粘性末端粘性末端(m dun)(m dun)连接连接第2页/共63页第三页，共64页。粘性末端粘性末端(m dun)(m dun)连接连接第3页/共63页第四页，共64页。双酶切，定向克隆双酶切，定向克隆第4页/共63页第五页，共64页。2、平末端、平末端(m dun)连接连接(blunt end ligation) ：提高提高(t go)(t go

2、)平末端平末端DNADNA连接的效率：连接的效率：加入大分子凝聚剂加入大分子凝聚剂, , 如：如：PEG8000PEG8000；加大连接酶的量加大连接酶的量第5页/共63页第六页，共64页。3 3、同聚物加尾法、同聚物加尾法 (homopolymer tails joining) (homopolymer tails joining) ：第6页/共63页第七页，共64页。第7页/共63页第八页，共64页。4 4、人工、人工(rngng)(rngng)接头连接法：接头连接法：Adapter:Adapter:化学合成化学合成第8页/共63页第九页，共64页。 载体载体(zit)DNA(zit)DN

3、A片段；片段； 目的目的DNADNA片段；片段； T4 DNA T4 DNA 连接酶；连接酶； 10 X buffer 10 X buffer第9页/共63页第十页，共64页。1 1、反应温度：、反应温度：1616度；度； 2 2、时间：过夜或、时间：过夜或1h1h；3 3、DNADNA量：量：50-100ng50-100ng；4 4、载体与目的、载体与目的(md)DNA(md)DNA比例比例 1 1：8 8（摩尔比）（摩尔比）；5 5、酶量、酶量连接反应注意连接反应注意(zh y)(zh y)：第10页/共63页第十一页，共64页。转移转移(zhuny)(zhuny)：第11页/共63页第十

4、二页，共64页。n转座转座(transposition )(transposition )：有：有些基因可以从一个位置移动到些基因可以从一个位置移动到另一位置，由可移动的另一位置，由可移动的DNA DNA 序序列（插入序列和转座子）介导。列（插入序列和转座子）介导。自然界的基因转移自然界的基因转移(zhuny)(zhuny)和重组和重组 ：基因基因(jyn)(jyn)转移转移第12页/共63页第十三页，共64页。基因基因(jyn)(jyn)重组：重组：第13页/共63页第十四页，共64页。当受体为细菌时：常采用电击当受体为细菌时：常采用电击(din j)(din j)法、热击法（氯法、热击法（

5、氯化钙法）化钙法）受体为真核生物时：电击受体为真核生物时：电击(din j)(din j)法，基因枪，显微注法，基因枪，显微注射。射。重组重组DNADNA分子导入受体：分子导入受体：第14页/共63页第十五页，共64页。连接产物连接产物第15页/共63页第十六页，共64页。基因枪转化基因枪转化(zhunhu)(zhunhu)：第16页/共63页第十七页，共64页。第17页/共63页第十八页，共64页。第18页/共63页第十九页，共64页。DNADNA显微显微(xin (xin wi)wi)注射法注射法第19页/共63页第二十页，共64页。筛选筛选(shixun)(shixun)：两个层次：重组

6、两个层次：重组/ /非重组非重组DNADNA， 阳性克隆（菌落）阳性克隆（菌落）方法：方法：第20页/共63页第二十一页，共64页。第21页/共63页第二十二页，共64页。重组重组(zhn z)质粒酶切鉴定的琼脂糖凝胶质粒酶切鉴定的琼脂糖凝胶电泳图电泳图1500bp第22页/共63页第二十三页，共64页。重组重组(zhn z)质粒酶切鉴定的琼脂糖凝胶电泳质粒酶切鉴定的琼脂糖凝胶电泳图图2第23页/共63页第二十四页，共64页。列（克隆的基因片段或基因组列（克隆的基因片段或基因组DNADNA或是细胞总或是细胞总RNARNA）及探针。）及探针。第24页/共63页第二十五页，共64页。第25页/共6

7、3页第二十六页，共64页。第26页/共63页第二十七页，共64页。第27页/共63页第二十八页，共64页。第28页/共63页第二十九页，共64页。Steps:第29页/共63页第三十页，共64页。第30页/共63页第三十一页，共64页。探针探针(tn zhn)(tn zhn)（probeprobe）：）：第31页/共63页第三十二页，共64页。第32页/共63页第三十三页，共64页。第33页/共63页第三十四页，共64页。随机随机(su j)(su j)引物法引物法DIG DIG 标记的探针标记的探针 第34页/共63页第三十五页，共64页。第35页/共63页第三十六页，共64页。第36页/共

8、63页第三十七页，共64页。第37页/共63页第三十八页，共64页。第38页/共63页第三十九页，共64页。第39页/共63页第四十页，共64页。第40页/共63页第四十一页，共64页。性位点性位点蛋白质电泳蛋白质电泳(din yn)(din yn)、印迹、印迹第41页/共63页第四十二页，共64页。酶）；酶）；n通过特异通过特异(ty)(ty)性反应显色性反应显色进行检测。进行检测。5 5、免疫测定、免疫测定第42页/共63页第四十三页，共64页。第43页/共63页第四十四页，共64页。基因文库技术基因文库技术(jsh) (jsh) 第44页/共63页第四十五页，共64页。按照外源按照外源

9、DNA DNA 片段的来源，基因文库分为：片段的来源，基因文库分为：基因组基因组 DNA DNA 文库（文库（genomic DNA librarygenomic DNA library）：）：cDNA cDNA 文库（文库（complementary DNA librarycomplementary DNA library）：）： cDNA cDNA 是由生物的某一特定器官或特定发育时期细是由生物的某一特定器官或特定发育时期细胞内的胞内的 mRNA mRNA 经体外反转录后形成经体外反转录后形成(xngchng)(xngchng)的双的双链链 cDNA cDNA，再将这些再将这些cDNAcD

10、NA与合适的载体重组后导入宿主细胞。，与合适的载体重组后导入宿主细胞。，这一组重组子带有该种生物的所有蛋白的编码基因。这一组重组子带有该种生物的所有蛋白的编码基因。 分类分类(fn li)：第45页/共63页第四十六页，共64页。基因组文库基因组文库(wnk)构建构建将某生物的全部基因组将某生物的全部基因组 DNA DNA 用限制性内切酶或用限制性内切酶或机械力量切割成一定长机械力量切割成一定长度范围的度范围的 DNA DNA 片段，与片段，与合适合适(hsh)(hsh)的载体体外的载体体外重组，并转化相应的宿重组，并转化相应的宿主细胞获得的所有阳性主细胞获得的所有阳性菌落。菌落。第46页/共

11、63页第四十七页，共64页。第47页/共63页第四十八页，共64页。第48页/共63页第四十九页，共64页。cDNA cDNA 文库构建文库构建(u jin)(u jin)流流程程第49页/共63页第五十页，共64页。1.1.核酸核酸(h (h sun)sun)杂交杂交第50页/共63页第五十一页，共64页。第51页/共63页第五十二页，共64页。2. 2. 菌液菌液PCRPCR进行重组进行重组(zhn z)(zhn z)克隆的快速筛选。克隆的快速筛选。基本方法：基本方法： 从抗性平板上挑取单菌落接种至从抗性平板上挑取单菌落接种至LBLB培养基中培养基中，振荡培养，取，振荡培养，取1L1L菌液

12、裂解制备模板，再进菌液裂解制备模板，再进行行PCRPCR筛选。筛选。第52页/共63页第五十三页，共64页。通过自动印迹或光引导化学合成技术在硅片、玻璃、凝胶通过自动印迹或光引导化学合成技术在硅片、玻璃、凝胶或尼龙膜上制造的生物分子微阵列。或尼龙膜上制造的生物分子微阵列。根据分子间的特异作用的原理，实现根据分子间的特异作用的原理，实现(shxin)(shxin)对细胞、蛋对细胞、蛋白质、基因等生物组分的准确、快速、大信息量的检测。白质、基因等生物组分的准确、快速、大信息量的检测。生物芯片生物芯片(shn w xn pin)(shn w xn pin)（BiochipBiochip）：）：第53

13、页/共63页第五十四页，共64页。第54页/共63页第五十五页，共64页。第55页/共63页第五十六页，共64页。stepssteps：芯片的制作芯片的制作(zhzu)(zhzu)； 样品的标记；样品的标记；探针与标记样品的分子杂交等。探针与标记样品的分子杂交等。第56页/共63页第五十七页，共64页。第57页/共63页第五十八页，共64页。第58页/共63页第五十九页，共64页。第59页/共63页第六十页，共64页。Thank you!第60页/共63页第六十一页，共64页。n3 3 试述试述Southern blot Southern blot 原理原理(yunl)(yunl)及应用。及应

14、用。复习复习(fx)题目题目第61页/共63页第六十二页，共64页。问答：问答：1 1 简述癌基因及其激活机制。简述癌基因及其激活机制。2 2 简述基因诊断中常用的分子生物学技术。简述基因诊断中常用的分子生物学技术。3 3 简述基因治疗的主要策略简述基因治疗的主要策略名词解释：名词解释：1 1 基因诊断（基因诊断（gene diagnosisgene diagnosis）2 SSCP2 SSCP3 PCR3 PCR4 DNA4 DNA指纹指纹5 5 基因干预基因干预(gny)(gny)6 RNA6 RNA干扰干扰第62页/共63页第六十三页，共64页。64感谢您的观看感谢您的观看(gunkn)。第63页/共63页第六十四页，共64页。