临床病例分析模板

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1、题名页地震后危重多发伤伴混合感染病例分析张山，李思，王文武XX大学，上海200032基金项目：国家高新技术研究发展计划（2009ZZ06）第一作者：张山，详细联系方式（电话、E-mail）通信作者：王文武，详细联系方式（电话、 E-mail）地震后危重多发伤伴混合感染病例分析张山，李思，王文武XX大学,上海200032摘要：为证实乙型肝炎病毒（hepatitis B virus, HBV） 3022nt-1787nt缺失突变体编码 蛋白TSX （源于DNA聚合酶读码框架，s为部分缺失的spacer区，X为截短的X 蛋白）具有抗a干扰素（IFN-a）作用并确定其功能区域，首先以聚合酶链反应（PC

2、R） 扩增获得TSX全长及片段TS（含TP区及部分缺失的spacer区），并克隆于 pcDNA3.1/HisC载体。重组载体及空载体pcDNA3.1/HisC给予终浓度为100 IU/ml 的IFN-a2a刺激，作用24 h后裂解细胞，酶联免疫吸附试验（ELISA）检测胞内氯 霉素乙酰基转移酶（CAT）含量。结果显示，与空白载体相比，随着TSX及TS重 组表达载体转染量的递增，Huh7胞内CAT值逐渐降低（n = 6, Pv0.05）,但TSX 与TS之间无显著差异（n = 6, P0.05）。本研究证实HBV 3022nt-1787nt缺失突变体 编码的TSX蛋白可抑制Huh7细胞对IFN-

3、a的反应性，其活性与其N端TP及部分 缺失的 Spacer 区有关。关键词：海分枝杆菌；转座子突变；斑马鱼；肉芽肿基金项目：国家高新技术研究发展计划（2009ZZ06）通信作者：王文武Corresponding autor. WANG Wenwu, E-mail: jmiCases analysis of severe multiple trauma with mixed infections among earthquake victimsZHANG Shan, LI Si, WANG WenwuXX Universi ty, Shanghai 200032, ChinaAbstract：

4、The purpose of the current study is to investigate the anti-IFN- a effects and to determine the functional region of the novel protein TSX encoded by the 3022nt-1787nt deletion mutant of hepatitis B virus (HBV). Regions coding for TSX (in frame with the opening reading frame of DNA polymerase, in wh

5、ich T stands for terminal protein, S for partially deleted spacer region, and X for truncated X protein) and TS (N-terminal of TSX containing terminal protein and partially deleted spacer region) were amplified by means of PCR and cloned into the pcDNA3.1/HisC vector separately. The recombinant vect

6、or was transfected into Huh7 hepatocytes individually by FuGENE6 transfection reagent, and the expression of the fusion protein was verified by Western blot analysis.The recombinant or empty vector was co-transfected to Huh7 hepatocytes with IFN-a response reporter plasmid p6-16CAT at the molar rati

7、o of 5:1, 10:1, 15:1 and 30:1, cells were treated with IFN- a2a 48 hours post-transfection. After 24 hours of stimulation, the cells were lysed and the intracellular CAT value was calculated by ELISA assay. The results demonstrated that, as compared to the empty vector, the intracellular CAT values

8、were gradually reduced as paralleled with an increasing amount of TSX or TS recombinant (n=6, pv0.05), while no significant differences were observed between them (n=6, pv0.05). It was concluded that the novel protein TSX encoded by the 3022nt-1787nt deletion mutant of HBV suppressed the response of

9、 Huh7 hepatocytes to IFN-a， and the N- terminal region was a functional domain for its anti-IFN-a effects.Key words： Mycobacterium marinum; Transposon; Zebrafish; Granuloma长久以来，分枝杆菌的细胞壁被认为是其致病性中的重要部分，他不仅可以帮 助结核菌抵抗多种恶劣的理化及宿主体内环境，有利于结核菌抵抗大多数常用的抗 生素，而且已证实多种细胞壁成分与其毒力密切相关1,2。此外，多种的抗结核药物， 如异烟肼和乙胺丁醇，作用的靶位点

10、位于细胞壁的代谢通路 3。因此研究分枝杆菌 细胞壁中与毒力相关的成分有可能为开发新的抗结核药提供新靶点，为发展新的预 防结核病的疫苗提供新线索。本研究利用噬菌体 MycoMarT7 转座子系统建立了海分枝杆菌的随机突变库， 以菌落形态及索状结构的改变为筛选标志获得了 3 个 mas 同源基因的插入突变株， 并探讨了其致病性。流行性乙型脑炎(epidemic encephalitis type B)是由乙型脑炎病毒引起的以脑 实质炎症为主要病变的中枢神经系统急性传染病，又称日本乙型脑炎1。临床上多 以急性起病、高热、意识障碍、抽搐、呼吸衰竭、脑膜刺激征为主要表现。为提高 临床医师对该疾病的认识，

11、我们对本院20052008年收治住院的30例乙型脑炎患者 流行病学及临床特征进行回顾性分析。1 临床材料1.1 病例患者，男性， 78 岁，农民。间断性咳嗽、咳痰 4 年，加重 1 个月，于 2008 年 10 月13 日入住甘肃省兰州市肺科医院。痰标本编号：866。患者自述4 年前开始每 遇天气转凉即出现咳嗽，咳白色黏液性痰，并伴气短，多次于外院就诊，诊断为“慢 性支气管炎，肺心病”。给予抗炎利痰对症治疗后，症状缓解。否认服用抗结核药。 入院前 1 个月上述症状逐渐加重，对症治疗，疗效欠佳。入院时查体：腋下体温36 C,心率80次/min,血压155/95 mmHg。神志清， 精神欠佳，体形

12、正常，扶入病房。咽部无充血，扁桃体无肿大，双侧呼吸动度减弱 叩诊过清音，双肺呼吸音粗，肺底可闻及细湿罗音。腹平软，无压痛反跳痛，肝脾 不大。血常规检查：白细胞2.9X109/L,淋巴细胞绝对值0.8X109/L,红细胞6.55x10i2/L, 血红蛋白含量208 g/L，平均红细胞血红蛋白含量31.7 pg。生化检查：谷丙转氨酶57 u/L,谷草转氨酶41 u/L，谷草转氨酶/谷丙转氨酶0.7，载脂蛋白A 0.94 g/L,载 脂蛋白B 1.18 g/L,乳酸脱氢酶260 u/L,腺苷脱胺酶31 u/L,转铁蛋白6.08 g/L,岸 微球蛋白3.3 mg/L。胸水生化显示总蛋白52 g/L,腺

13、苷脱胺酶64 g/L,转铁蛋白1.26 g/L。胸水涂片见大量散在的淋巴细胞。胸水中甲胎蛋白0.83 ng/ml、癌胚抗原0.58 ng/m 1、肿瘤相关因子18.78 u/ml。入院后常规痰检示痰涂片抗酸杆菌阴性。胸部计 算机断层扫描(computed tomography，CT)显示：双肺间质纹理增重，肺内散布片 絮状高密度灶,伴双侧胸腔积液,纵隔可见钙化的淋巴结,左心室增大。入院诊断为肺心病。肺部有炎症，给予左氧氟沙星0.4 g/d,静脉点滴1周；头 抱他啶2 g/d,静脉点滴1 d；诊断性抗痨治疗(对氨基水杨酸异烟肼片0.3 g,每 天1次；利福平0.45 g,每天1次；乙胺丁醇0.7

14、5 g,每天1次)和对症支持治疗， 15 d后症状好转出院。1.2 材料和方法1.2.1 主要试剂 Middlebrook 7H9 (8X07131 )、Middlebrook MGIT-960 液体培养 基购于美国BD公司，小牛血清组分v (A8020)和过氧化氢酶(C8070)购于瑞士 罗氏制药公司，基因组提取试剂盒(N9021)购于东盛生物有限公司，DNA STAR聚 合酶和胶回收试剂盒购于TaKaRa, Taq DNA聚合酶为美国Fermentas公司产品，鸡 蛋为正大鲜鸡蛋。1.2.2显微镜镜检 取患者晨起漱口后咳出深部的痰做检查。抗酸染色：将痰涂 片,加热固定,碱性石炭酸复红初染,

15、 3%盐酸酒精脱色,亚甲基蓝复染,干燥后光 学显微镜下镜检。革兰染色：将痰涂片，自然干燥，结晶紫初染，碘液媒染， 95%乙醇脱色,稀释复红复染,干燥后光学显微镜下镜检8。1.2.3痰标本的细菌培养 取患者晨起漱口后咳出深部的痰做标本，经消化、离心、 弃上清液后加入适量磷酸缓冲液(phosphate-buffered saline, PBS)，重悬、沉淀， 取300 “分别接种于Middlebrook MGIT 7H9液体、含蔗糖的7H9 (7H9-L)半固体、 不含蔗糖的Middlebrook 7H9 (7H9-B)半固体、含氯化钠的92-3TB (92-3 TB-L) 液体和不含氯化钠的92

16、-3TB (92-3 TB-B)液体培养基9及罗氏(Lownstein-Jenson, L-J)培养基中，37 C静置培养。1.2.4细菌回复实验 将该菌株培养至呈煎蛋样生长的L型细菌，接种于罗氏培养 基或7H9-B半固体培养基，观察细菌生长状况及形态改变。1.2.5扫描电镜观察 刮取培养的菌落置于1.5 ml的Eppendorf管中，加入3%磷酸 戊二醛固定过夜，在兰州大学医学实验中心电镜室处理并扫描电镜观察。2 结果痰标本经培养，在92-3 TB-L液体培养基出现浑浊，表明有细菌生长。在7H9-L 半固体含蔗糖培养基中有油煎蛋样的菌落出现。抗酸染色可见抗酸染色阴性、大小 不等、圆形或短杆状

17、的细菌。在罗氏培养基和7H9-B中传代培养2代后，可见有少 量细菌回复为抗酸染色弱阳性杆状菌（图 1）。革兰染色可见紫红色杆状菌（图 2D）。 扫描电子显微镜下可见传代培养后菌落呈团块状生长，菌体呈杆状。 PCR 产物扩增 16S rRNA DNA的测序结果与支气管戈登菌DSM 43247相似性100% （图2）,可 见从该患者痰液中分离培养出支气管戈登菌的L型细菌。药敏实验显示，该细菌对 利福平、利福喷丁、阿莫西林、左氧氟沙星和克拉霉素敏感，对异烟肼、吡嗪酰胺 乙胺丁醇、对氨基水杨酸、甲硝唑和呋喃唑酮耐药（图 3、表 1）。3 讨论在结核分枝杆菌中，pps位点（包括fadD26至fadD28

18、的全部基因，见图3）45kb 的大片段与 PDIM 的合成密切相关。3.1 流行病学特征目前全世界乙型脑炎每年发病约50 000例，其中约1/3死亡，存活者20%30%有 神经麻痹和心理改变等严重后遗症。乙型脑炎主要经蚊虫叮咬及吸血传播，传播媒 介是生活在水稻田、沼泽地里的雌性蚊虫（国内的主要传播媒介为三带喙库蚊）， 故乙型脑炎一般夏、秋季多发，集中在79月份，占全年病例的90%以上3。3.2 临床特点乙型脑炎临床表现主要有急性起病，中高热，头痛，呕吐，意识障碍，肌力、 肌张力异常，脑膜刺激征、病理征阳性。重型或极重型可并发肺炎、呼吸循环衰竭、 上消化道出血而死亡。3.3 治疗和预防对于乙型脑

19、炎目前尚无特效抗病毒药物，对症及营养支持治疗是决定抢救成功 的关键。高热可予以物理降温，如温水或酒精擦浴。惊厥或抽搐时应及时吸痰，保 持呼吸道通畅；并进行脱水，降低颅内压力。一旦发生呼吸衰竭，应及时给予呼吸 兴奋剂，必要时应用呼吸机进行人工辅助呼吸。本研究中10例患者未进行过预防接种，15例既往是否接种乙型脑炎疫苗情况不 详，提示人群对接种乙型脑炎疫苗意识不强，故疾病控制部门应在流行季节来临前 加强宣传教育，提高预防接种率。参考文献1 Daffe M, Etienne G. The capsule of Mycobacterium tuberculosis and its implicatio

20、ns for pathogenicity J. Tuber Lung Dis, 1999, 79(3): 153-169.2 Stamm LM, Brown EJ. Mycobacterium marinum: the generalization and specialization of a pathogenic mycobacterium J. Microbes Infect, 2004, 6(15): 1418-1428. 罗云.安全科学理论体系的发展及趋势探讨M.见：白春华，何学秋，吴宗之.21 世纪安全科学与技术的发展趋势北京：科学出版社，2000：1-5.4 Glickman M

21、S, Cox JS, Jacobs WR Jr. A novel mycolic acid cyclopropane synthetase is required for cording, persistence, and virulence of Mycobacterium tuberculosis J. Mol Cell, 2000, 5(4): 717-727.5 Jacobs WR Jr, Barletta RG, Udani R, Chan J, Kalkut G, Sosne G, Kieser T, Sarkis GJ, Hatfull GF, Bloom BR. Rapid a

22、ssessment of drug susceptibilities ofMycobacterium tuberculosis by means of luciferase reporter phages J. Science, 1993, 260(5109): 819-822.Colonial morphology of the wild2type strain, while B is the colonial morphology of the transposon inserting mutant02C10 ( Image taken with a Canon EOF100).图1 海分

23、枝杆菌在固体培养基上的菌落形态Fig. 1 The colonial morphology ofM. marinum on solid mediumA: fliG mutant; B: Wlid type strain.图2空肠弯曲菌fliG突变株小鼠空肠定植能力改变Fig.2 Change of colonization ability on mouse jejunum in C. jejunifliG mutantGrowth of M. marinum in J774A.1 cell cultures1.3+061.3+051.3+041.3+031.3+021.3+011.3+000d

24、ay 2day 4day 6day 8dayWild Type 02C10Day after infection图3海分枝杆菌在巨噬细胞J774A11中的生长曲线Fig.3 Growth of M. marinum wild-type and 02C10 mutant in J774A.1 cell cultures表 1 RT 及 PCR 引物NameSequence(5-3)UseSFPCVaaaGGCGCGCCTACGTATCCAGGGAthe forward primer for PCV2 specificGGCGTTACCGCAGAAORF2SRPCV ccTTAATTAAATGAC

25、GTACCAGGG AGGCGTTACCGCAGSF11422 GCGTCCCTCCCACATGCCTTCSR12582 GCCTCGCTCACCACCTGTTTCSF5CGTATAGGTGTTGGCTCTATGCthe reverse primer for PCV2 specific ORF2the forward primer for vCPV specific gene the reverse primer for vCPV specific gene the forward primer of vCPV sgmRNA2SR12661 TTTACAGGTCTCGGCTTCthe reverse primer for vCPV sgmRNA2QstGAGTGACGAGGACTCGAGCGCATthe primer for reverse transcriptionTab.1 Oligonucleotides used for PCR and RTGCTTTTTTTTTTTTTTThe restriction sites are underlined.