DNA测序分析常见问题整理学习教案

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1、会计学1DNA测序分析测序分析(fnx)常见问题整理常见问题整理第一页，共32页。四色图谱四色图谱(tp)：每一种颜色对应一：每一种颜色对应一种碱基种碱基ATCG第1页/共31页第二页，共32页。 影响测序质量的主要影响测序质量的主要(zhyo)(zhyo)因因素素第2页/共31页第三页，共32页。 一、引物对测序结果一、引物对测序结果(ji gu)(ji gu)的影响的影响第3页/共31页第四页，共32页。合成时部分引物合成时部分引物多多一个碱基一个碱基合成时部分引物合成时部分引物少少一个碱基一个碱基 现象：每个峰后面(hu mian)有个同样荧光信号的小“尾巴”。 原因：合成时引物多一个碱

2、基。 对策：重新合成引物 现象：每个峰前面有个同样荧光信号的小“尾巴(wi ba)”。 原因：合成时引物多一个碱基。 对策：重新合成引物第4页/共31页第五页，共32页。引物（模板引物（模板(mbn)）不纯）不纯 现象：整个(zhngg)峰图噪音都比较高。（区别与小片段的干扰） 原因：引物（模板）纯度太低，含有较多杂质 对策：建议使用HPLC（柱子纯化）或PAGE 纯化的测序引物。脱盐纯化的引物纯度较低，适合做普通PCR，但不建议用来测序。第5页/共31页第六页，共32页。模板模板(mbn)上没有引物结合位点上没有引物结合位点 现象：没有特异性的测序峰图 原因：引物无法(wf)结合模板 对策重

3、新设计引物第6页/共31页第七页，共32页。引物二聚体引物二聚体 现象：前面100多bp噪音高，后面正常（引物二聚体片段小大在100bp左右） 原因(yunyn)：引物二聚体未去除干净 对策：割胶纯化第7页/共31页第八页，共32页。双引物结合双引物结合(jih) 现象：从一开始（区别于非单克隆）就出现两套峰 原因：模板(mbn)有两个引物结合位点，同时和两个引物结合 对策：重新设计单个引物第8页/共31页第九页，共32页。 二、模板对测序结果二、模板对测序结果(ji gu)(ji gu)的影的影响响第9页/共31页第十页，共32页。噪音信号高噪音信号高终止峰PCR正常终止后面的噪音峰PCR正

4、常终止正常模板正常模板(mbn)与噪音与噪音第10页/共31页第十一页，共32页。模板模板(mbn)不纯（非特异性不纯（非特异性PCR产物）产物） 现象：每个峰下面都有其它颜色 原因：PCR主带与杂带混在一起(yq)测序 对策：凝胶电泳回收主带，重新测序割胶割胶(gjio)纯化纯化第11页/共31页第十二页，共32页。点突变点突变(tbin)（SNP）突变突变(tbin)点点如果模板如果模板(mbn)有单核苷酸（碱基）突变（有单核苷酸（碱基）突变（SNP），测序图形中其他的位点一般都是单一的），测序图形中其他的位点一般都是单一的峰形，然后突然在某一个位点出现重叠峰峰形，然后突然在某一个位点出现

5、重叠峰(如图中箭头所示如图中箭头所示)。 第12页/共31页第十三页，共32页。移码突变移码突变(tbin)在450bp处因点突变导致(dozh)移码，在528bp处又因点突变恢复第13页/共31页第十四页，共32页。杂合子杂合子(hz)杂合杂合(z h)变点变点杂合信号(xnho)处的套峰强度大小相等，都相当于正常峰值的一半。第14页/共31页第十五页，共32页。非单克隆非单克隆特征：左边清晰，右边全部像杂合子特征：左边清晰，右边全部像杂合子原因原因(yunyn)：挑克隆时两个质粒混在一起：挑克隆时两个质粒混在一起对策：新挑克隆，重新制对策：新挑克隆，重新制DNA第15页/共31页第十六页，

6、共32页。 三、纯化三、纯化(chn hu)(chn hu)对测序结果的对测序结果的影响影响第16页/共31页第十七页，共32页。染料染料(rnlio)峰峰特征：染料峰位于序列(xli)的前100bp左右，是残余的A、T、C、G、4个BigDye峰，其不影响其它序列(xli)的可靠性。第17页/共31页第十八页，共32页。酒精酒精(jijng)峰峰特征：酒精峰位于序列的200bp-300bp碱基之间，图谱被“透明(tumng)”抬高，其同样不影响其它序列的可靠性。第18页/共31页第十九页，共32页。荧光荧光(ynggung)物质污染物质污染 现象：红色峰异常高。 原因(yunyn)：未知大分

7、子荧光物质污染，恰好是红色，被软件误认为红色峰。 对策：依次更换水、缓冲液、甲酰胺、测序胶、毛细管；清洗或更换胶引导块、针筒。第19页/共31页第二十页，共32页。“钉子钉子(dng zi)”峰峰 现象：四色并存突然拔起(b q)的尖峰，峰形锐利。 原因：毛细管内有气泡、灰尘、尿素结晶等，对激光全反射。 对策 灌胶时，避免气泡产生； 上样前，样品先离心； 毛细管、检测窗口保持清洁； 胶内有尿素结晶时，注意不要吸进注射器； 样品纯化干净。第20页/共31页第二十一页，共32页。有机物污染有机物污染(wrn)（瀑布效应）（瀑布效应） 现象：基线从高处突然下降。 原因：有机物进入毛细管，受激发产生一

8、定波长的荧光，抬高(ti o)基线。 对策：依次更换水、缓冲液、甲酰胺、测序胶、毛细管；清洗或更换胶引导块、针筒。第21页/共31页第二十二页，共32页。 四、困难模板对测序结果四、困难模板对测序结果(ji (ji gu)gu)的影响的影响第22页/共31页第二十三页，共32页。特殊特殊(tsh)结构结构第23页/共31页第二十四页，共32页。Poly结构结构(jigu)Poly在序列的前端对信号(xnho)影响较小, Poly在序列的后端对信号(xnho)影响较大。Poly-G/poly-C 很容易(rngy)导致信号中断和信号乱。第24页/共31页第二十五页，共32页。高高GCPoly-G

9、/poly-C 是高是高GC的一种的一种(y zhn)，很容易导致信号衰减。，很容易导致信号衰减。局部高局部高GC一般会导致信号一般会导致信号(xnho)中断和乱峰。中断和乱峰。第25页/共31页第二十六页，共32页。重复重复(chngf)序列序列GT 重复导致信号重复导致信号(xnho)衰减衰减A/G重复导致信号重复导致信号(xnho)衰减衰减或信号或信号(xnho)乱乱第26页/共31页第二十七页，共32页。回文结构回文结构其他其他(qt)复杂的二级结构也会导致衰减复杂的二级结构也会导致衰减第27页/共31页第二十八页，共32页。 四、机器因素对测序结果四、机器因素对测序结果(ji gu)(ji gu)的影响的影响第28页/共31页第二十九页，共32页。毛细管寿命毛细管寿命(shumng)突起部分峰的左右峰的左右(zuyu)不对称，不对称，向后拖，有小突起向后拖，有小突起第29页/共31页第三十页，共32页。第30页/共31页第三十一页，共32页。感谢您的观看感谢您的观看(gunkn)。第31页/共31页第三十二页，共32页。