PCR过程问题全解

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1、如何防止PCR形成引物二聚体？在PCR后的电泳带形成很宽很亮的带，对照marker时都不容易看出其大小，具体是什 么原因呢？ PCR时模板DNA浓度一般是多少最合适？答：1这条亮带如果在lOObp 下就可以考虑是引物二聚体了，形成引物二聚体的原因 很多，如引物设计的不好，在两端容易形成回文结构或是两条引物之间也可能会互补配对； 退火温度没有达到最佳，实在不行就做个温度梯度吧；再就是试着改变一下循环数，也许会 有帮助。PCR模板大约在104-106个拷贝。 答2：我觉得是目的条带含量太多了，如果点样太多，负载量太大，就会造成跑胶时条 带太宽。可以试着减少模板量，稀释10倍或是减少循环数。答3：1

2、.从引物自身着手，重新设计引物，这是最根本解决这一问题的办法；2. 可能模板有问题；PCR后的电泳带形成很宽很亮的带，可能是模板浓度过高或者循 环次数过多所导致；3. Taq酶，引物，Mg2+浓度可能过高，可降低它们的浓度；4. 取你所要加的上下游引物混合后，在100摄氏度下的沸水中煮5分钟，然后迅速拿 出至于冰块之上瞬时冷却，这时再加入反应体系当中，引物二聚体就会消失的；5. 所配MIX中加5%的甘油或者5%的DMSO,可以增强特异性；6. PCR反应体系的配制在冰上进行，最后加TAq酶，PCR结束后，产物勿放置在室温下 过长时间，有人认为室温下有些Taq酶会将多余的引物合成为二聚体。7.

3、增加循环数可以适当降低引物二聚体；8. 降低退火温度后有条带，则应逐渐提高温度，若提高温度的同时产物量减少，则考 虑增加镁离子浓度（根据扩增片断长度而定，片段长则相应镁离子浓度应该高一些）；9. 若降低退火温度，发现还是只有引物二聚体，而且镁离子的浓度在20-25mmol/1没 有区别，则考虑Buffer等试剂没有完全融解、混匀，导致吸取的试剂浓度不对。10. 以上次的per产物作模板二次per,可以提高引物与模板的特异性，减少引物二聚 体，如果两次时间间隔短的话，可以把原产物稀释1001000倍，如果间隔较长可以稀释 50100倍。PCR假阴性的原因分析PCR的假阳性问题是在PCR诞生之初就

4、被深刻认识到了，同时由于造成假阳性的因素相对单一，因此假阳性并不是困惑检验工作的主要原因。如果一个项目只是阳性率高敏感性好的话，那么可以认为其阴性结果具备很高的可排除性，仍然有相当的临床适用价值。但PCR 的假阴性在检验工作中仍很严重，并且用些因素经常被人忽略，严重的影响了PCR的使用。 可以想象一种假阳性和假阴性都很高的项目，有什么样的诊断价值。造成PCR假阴性的原因 是复杂的，也是多样的。主要有：1. PCR仪本身的质量问题。PCR仪设计原理上的差异和经常出现的质量问题（如：温控不准等）给临床带来了诸如非特异性扩增（假阳性）、扩增效率下降（假阴性）等问题.2. 离心机问题。离心机的质量或使

5、用不正确，造成离心标本模板没有分离出来造成假阴 性，窃以为这是最易被忽视的问题。其时离心机使用问题不仅在PCR，在整个检验工作中都 是最易被忽视的问题，只是因为在其他工作中不象PCR那样明显影响检测结果罢了。离心机是常用的固液分离设备，其利用离心过程中的离心力而将密度不同的物质分离出 来。因此离心机的关键在于离心加速度而不是转速，根据牛顿定律可知离心力加速度与转速 和有效半径的有关的，因此对于不同有效半径的离心机相同的转速其离心加速度是不同的， 转速的调节要因离心机而异，但很遗憾，日常工作中忽视了这个问题。有效半径短的离心加 速度就小，同样的时间离心效果就差可能造成分离不出导致假阴性。同时由于

6、高速离心机高 速旋转与空气摩擦会产生大量的热，因此对于称能上几万转/分而没有抽真空的离心机实际 转速本人持怀疑态度。3试剂开壳剂和操作问题造成标本DNA没有暴露出来，致使扩增无法进行，这是造成假 阴性的又一主要因素。问题1：无扩增产物现象：正对照有条带，而样品则无原因:1. 模板:含有抑制物，含量低2. Buffer对样品不合适3. 引物设计不当或者发生降解4. 反应条件：退火温度太高，延伸时间太短对策:1. 纯化模板或者使用试剂盒提取模板DNA或加大模板的用量2. 更换Buffer或调整浓度3. 重新设计引物（避免链间二聚体和链内二级结构）或者换一管新引物4. 降低退火温度、延长延伸时间问题

7、2：非特异性扩增现象：条带与预计的大小不一致或者非特异性扩增带原因1. 引物特异性差2. 模板或引物浓度过高3. 酶量过多4. Mg2+浓度偏高5. 退火温度偏低6. 循环次数过多对策：1重新设计引物或者使用巢式PCR2. 适当降低模板或引物浓度3. 适当减少酶量4. 降低镁离子浓度5. 适当提高退火温度或使用二阶段温度法6. 减少循环次数问题3：拖尾现象：产物在凝胶上呈Smear状态。原因：1. 模板不纯2. Buffer不合适3. 退火温度偏低4. 酶量过多5. dNTP、Mg 2+浓度偏高6. 循环次数过多对策：1. 纯化模板2. 更换 Buffer3. 适当提高退火温度4. 适量用酶5

8、. 适当降低dNTP和镁离子的浓度6. 减少循环次数问题 4：假阳性现象：空白对照出现目的扩增产物原因：靶序列或扩增产物的交*污染对策：1. 操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外；2. 除酶及不能耐高温的物质外，所有试剂或器材均应高压消毒。所用离心管 及加样枪头等均应一次性使用。3. 各种试剂最好先进行分装，然后低温贮存请问 PCR 引物存放时间是多少？这要看是什么状态，要是粉末的话，在20 度可以存放好几年；要是已经把引物稀释 成液体状态的话，存放时间就要短一点了，但也可以存放一年左右的时间，甚至更长。不过这也要看你们实验室的冰箱是不是经常开启，要是是的话，存放时间就很受

9、影响 实验室的冰箱就是经常打开，而且有时候大家找东西要找好长时间，所以引物总是用半个多 月的时间，效力就下降了，PCR后的条带明显就没有以前亮了。建议你合成引物的时候，让公司每个0D分装成一管，每次你用的时候，取一管稀释成 使用浓度；或者先稀释到储存浓度，分装后要用的时候再稀释到使用浓度。另外一定要注意 避免反复冻融，反复冻融会使存放时间变短的。最简单的就是分装了,以储存浓度保存,稀释10或20微升,就可以用好些次,即可避免反 复冻融还可以避免整管引物都被污染.干粉20 度可以保存一年，稀释后20度可以保存半年。可以先稀释成lOOuM，分装成几管。然后再稀释成50uM和20uM的。每次用20u

10、M的做PCR 即可。尽量避免反复冻融。稀释用的水PH值要求大于7 (TE比灭菌去离子水好)，并且无菌。真空干燥的DNA呈干膜状或粉末状在离心管底部，开启瓶盖时小心不要丢失稀释方法：1 0D260引物干粉约为33微克；碱基的平均分子量为324.5；引物的分子量=碱基数x碱基的平均分子量；引物的摩尔数=质量数 / 引物分子量举例：一管标明为2 0D的20碱基的引物，分子量=20 x 324.5=6490 质量数=2 x 33 =66 ug摩尔数=66 / 6490 =0.010 umol= 10 nmol若您需要溶解为10uM(=10pmol/ul)的溶液，只需加10/=10pmol/ul,=1m

11、lddH2 0充分 溶解即可。如何提高PCR反应的特异性引物引物设计：引物长度适当，18-24mers,并保证序列独特性，以降低序列在非目的片段 中存在的可能性，但长度大于24核苷的引物并不意味着有更高的特异性，较长的序列可能 会与错误配对序列杂交，反而降低特异性，而且长序列比短序列杂交慢，影响产量；引物 浓度：引物的浓度会影响特异性。最佳的引物浓度一般在0.1到0.5uM。较高的引物浓度 会导致非特异性产物扩增。 -生物秀实验频道Mg2+较高的Mg2+浓度可以增加产量，但也会降低特异性。为了确定最佳浓度，从1mM到3mM， 以0.5mM递增，进行最适Mg2+浓度测定退火温度Tm对于设定PCR

12、退火温度是必需的。退火温度一般设定为比引物的Tm低5C的温度。 合理的退火温度为55-70C。在理想状态下，退火温度应足够低，以保证引物同目的序列有 效退火，同时还要足够高，以减少非特异性结合巢式PCR使用巢式引物进行连续多轮扩增，由于同两套引物都互补的靶序列很少，巢式PCR 的使用降低了扩增多个靶位点的可能性，从而提高PCR反应的特异性和灵敏度递减 PCR通过在PCR的前几个循环使用严谨的退火条件提高特异性。循环设在比估算的Tm高大 约5C的退火温度下开始，然后每个循环降低1C到2C,直到退火温度低于Tm5C。这样， 特异性最高的目的模板会被优先扩增，并在随后的循环中继续扩增占据优势热启动P

13、CR通过抑制一种基本成分延迟DNA合成，直到PCR仪达到变性温度。最常用的是热启动 DNA聚合酶，常温时该酶活性被抑制，94-95C加热数分钟后回复正常活力开始反应，这样 可以避免起始循环温度下的非特异性扩增，大大提高了 PCR反应的灵敏度及特异性。热启动 PCR是除了好的引物设计之外，提高PCR特异性最重要的方法之一PCR 增强剂包括甲酰胺，DMSO,甘油，甜菜碱等，能构降低熔解温度，从而有助于引物退火并辅助DNA 聚合酶延伸通过二级结构区。PCR 扩增过程中常见的问题及解决方法PCR技术具有高度的特异性、选择性、灵敏性，而且快速、简便、易于自动化，因此在 临床医学工作中受到广泛的重视及合理

14、的应用。目前在我国许多基层医疗单位均已相继开展 PCR研究用应用工作。PCR技术很简单，原理也很清楚，因此有条件的单位都能较顺利地上 马，但毕竟PCR技术是一种新生事物，受到许多条件因素的影响，所以要做得好也不容易。 在 PCR 技术应用过程中会遇到这样或那样的问题，更甚至会得到与事实完成相反的结果。为 了使我们能够顺利地开展PCR工作，更好地发挥PCR技术的工具作用，我们根据多年来PCR 工作总结的经验，对PCR扩增过程中经常出现的一些问题进行简要的总结，提供给广大科研 工作者作为参考，抛砖引玉，不足之处欢迎指正。一、假阳性扩增 在实验过程中有时会碰到所检验的样本全部阳性，而且扩增产物电泳条

15、带亮度均一，这 是扩增系统受到污染时最典型的一种表现，需仔细检查，排除污染源，一般应从以下步骤着手：1. 试剂污染：厂方提供的试剂或其中的某种组分在出厂或运输、贮存过程中受到污染。检测方法，可 按试剂盒说明书将试剂分装好，直接置于PCR仪中扩增（不加阴性对照，可加适量蒸馏水）， 便可简单而有效地判断试剂是否已受到污染。2. 实验室污染：这是最常见的污染源，由于PCR技术可以在几个小时内将模板中某些特异性序列扩增到 数百万倍以上，扩弗产物可能在电泳等过程中污染移液器、操作台或随着蒸发所形成气溶胶 而污染整个实验室。扩增产物又是最有效的模板，一旦出现产物污染其污染程度都较严重。 判断方法：可以将实

16、验中最关键步骤如试剂分装、样品处理等转移到一个新的环境中或转移 到超净工作台中完成。当然，所用的移液器、吸咀管（离心管）都应彻底更换。解决方法： 实验室污染是PCR扩增过程中最易出现的现象，而且一旦出现污染，消除污染源又极其困难， 往往需对整个实验室及实验器材彻底清洗处理，所以应该以预防为主，实验过程中严格遵守 实验基本要求，样品处理与扩增产物及电泳应尽量分开，最好能在两个房间进行。扩增前处 理所用的移液器及扩增后点样用的移液器应严格地分开，不可互换。PCR室应保持良好的通 风、清洁、最好能专用。3. 采样污染：在实验过程中，有时会出现一批结果阳性率很高，一批结果阳性率又下降很多，如此反 复，

17、这种现象大都是由于采样时污染所致，一般来讲正规试剂生产厂家，其试剂出厂时都要 经过严格的质量检测、批间，特别是批内差异都极小，不致出现如此明显的反复，这种现象 主要是由于收集样本的试管或吸管受到污染所致。PCR扩增非常敏感，而一般实验室对重复 使用的试管所进行的洗涤方法往注不能去除痕量DNA，这些痕量DNA便成为PCR模板，出现 阳性扩增结果，由于采样试管受污染程度不一，所以出现忽高忽低的现象解决方法建议使用 一次试管及吸咀取样。二、假阴性扩增： 如果连续几次扩增结果都是阴性，或已知阳性样本出现阴性扩增结果，一般认为这是假 阴性，出现这现象有以下几种原因：1 仪器故障：出现全阴结果，首先考虑到

18、仪器运转是否正常。正确判断仪器的工作状况，是排除假阴 性其它原因的基础，仪器运转是否正常是PCR扩增最关键的步聚之一。判断仪器是否正常，首先要测定加热体的温度是否准确，波动范围是否答合要求，各孔之间差异是否符合要求，PCR扩增往往对仪器加热温度及各管间的差异要求有很高的精度，如果误差太大，势必出现 假阴性。必须注意的是不能过信名牌，我们经常发现一些名牌机器温度差异高达二度以上。2. 试剂失效或无效：了解机器是否正常，便可对试剂进行检测。首先要了解试剂是否超过有效期，试存放方 法是否达到要求，如果试剂盒在有效期内，贮存方法是正确，那么就应该仔细、慎重地判断 试剂是否是无效试剂或称不合格试剂。可以

19、用已知阳性样本，或试剂盒提供的阳性对照，严 格按说明书操作扩增一次，然后把扩增产物用双蒸水稀释1000倍，作为模板进行第二次扩 增，判断结果，如果是阴性说明试剂无效或不合格，如果结果阳性那么可用以下方法判定试 剂的灵敏度。3. 试剂的敏感度：有时试剂检测的阳性率偏低，所谓阳性率偏率就是指出现假阴性结果，这种现象往往与 以下三种因素有关：试剂质量不过关；操作方法不规范；主观判断标准不科学。对于 试剂质量及操作是否正确这两点是比较容易检查并合理改进。这里着重提一下：目前经常碰 到的一些不科学概念，我们习惯用某些样本应该阴性，某些样本应该阳性，或简单地以阳性 率。主观概念判断试剂是否合格这是极不科学

20、的主观推论。如对乙肝血清的测定，就不能用 抽象的阳性率应该是60或20这样的概念来判断，同样也不能用“二对半”的结果评判“PCR结果”，这是因为“二对半”与“PCR”是两种完全不同的检测方法，其检测结果的 意义有质的区别，它为医务人员提供的信息是大不相同的，更加之所使用的“二对半”试剂 是否能作为质量评价标准仍待考定。目前世界上较公认的标准品只有雅培的“两对半”试 剂，国内的“二对半”试剂据卫生部抽查资料表明，一度合格率在50以下，怎么可能作 为质量评定标准呢！对试剂敏感度的评价标准应该使用下述方法科学地评价，首先选择标准 样本如HBV全序列质粒，标准阳性血清，结核菌菌体等用合适的介质如血清、

21、痰液等进行有 限稀释按1： 10、1： 100、1： 1000、1： 10000如此逐步提高稀释度价其试剂的敏感度，一 般认为如果标准阳性乙肝的血清用正常血清稀释10000倍以上，结核菌每毫升中在100个左 右仍能测出阳性结果时，试剂的敏感度是足够的，判断试剂的灵敏度是足够的，判断试剂的 灵敏度后仍需判断试剂的检测覆盖，因为病原微生物有不同的型或变异株，合格的试剂不应 漏检。最后还要判断试剂盒的异性，一般的实验室可以用不同病原体的样本按说明书操作来 判断其对其它病原体扩增时是否也有阳性出现，其特异可达到怎样的精度，经过以上三个方 面的研究便可以科学地判断试剂的质量。三、扩增产物拖尾有时扩增产物

22、电泳后出现一个个萤光团（Smear现象）或出现一连串的条带，这些种现 象主要与以下几种因素有关：1扩增系统不完善：这种现象表明出现非特异性扩增，而产生非特异性扩增与扩增系统中镁离子浓度、引物 浓度、DNTP浓度有密切关系，需认真调整以期避免这种现象出现。另外也可以适当提高退 火温度，从而提高扩增特异性。2. 模板处理方法不完善：PCR扩增技术的原理虽然非常简单，但这一技术的合理应用是极其复杂的，如对PCR主 要成分之一 DNA聚合酶的影响因素很多，这些因子是怎样作用于聚合酶，其作用机制至今仍 不清楚，因此对样本处理不当不妥可能抑制扩增，也可能导致非特异扩增。一般分泌物样本， 应取脱落细胞为主，

23、避免采集过多的脓性分泌物，痰液样本一定要充分液化，等等。3. 引物设计不合理：引物设计应遵循以下几个原则。首先，引物一般应由15-30个BP组成；其次，引物中 碱基应是随机分布，不能有一串相同碱基或出现其它不常见结构；第三，GC碱基含量应在 45-55%左右；第四，两个引物在3未端不能出现同源性。其中以引物与基因组之间的同 源性是产生非特异性扩增的最主要原因，而我们一般在设计引物时往往只了解其基因组中的 某一段序列，因此我们必须充分利用这些资料巧妙地设计出一组合理的引物，并通过反复比 较、证实，最后才能确定其能否用于检测。四、产物电泳单萤光带及多萤光带一般PCR扩增后，对扩增结果的判断最简单的

24、方法 是，琼脂糖电泳，溴乙淀染色，在320nm的紫外激发观察其萤光条带，如果有明显和特异性 扩增产物，就会在电泳平板预期的位置出现一条清晰的萤光亮带，按标准扩增系统配制的反 应液，其引物浓度在0.1-0.5mM, 般经30个循环扩增后，仍有相当数量的游离引物存在, 因此在电泳平板就有一条20BP左右（电泳速度较快）的淡淡的引物萤光带，这样每次电泳 结果就有两条荥光带，一条在前面的，每个点样样本都有的引物带。引物设计相当重要，由于基因组有庞大数量的DNA序列，除了特异性的扩增外，往往很 容易产生非特异性产物。如果引物与基因组存在较广泛的同源性，那么就会出现严重的非特 异性扩弗，引物不仅与特异性的

25、扩增区域结合，而且也与其它区域发生一系列非特异性结合， 而选择引物时，常须考虑敏感性问题，特别是临床检验试剂盒，为了能把少至几个病原体检 出，我们大都采用在病原体基因组中重复出现的DNA序列设计引物，如果这些重复序列没有 严格的同源性，就在可能出现不同长度的扩增产物而出现多条带扩增。病原体变异，与前面所述一样，我们为得高敏感性经常使用具有重复序列的基因作为引 物设计的区段，在有些病原体，比如结核杆菌在治病过程中，会发生严重畸变，也包括其遗 传物质的变化，出现染色体的缺失、不等位交换、其它序列的插入等。如果这些缺失与不等 位交换正好发生在我们所选择的扩增序列上，也会出现不同长度的扩增产物，从而产

26、生多条 扩增产物带。PCR基因扩增技术简单易行，应用日趋广泛，但其影响因素很多，在实践过程中时常 现现这样或那样的问题，甚至得不到预期的结果，或出现无法解释的现象。诚然，近年来在 大量科学工作者的共同努力下，取得了许多宝贵的经验，使这一技术日趋完善，毕竟PCR 是一项近几年才出现的新技术，许多问题至今仍然不能得到很好地解释或解决。想信随着对 PCR的深入研究，在PCR的应用过程中不断总结经验，PCR这一新技术将会为人类的发展作 出更大的贡献。PCR产物的电泳检测时间一般为48h以内，有些最好于当日电泳检测，大于48h后带型不规则甚致消失。 假阴性，不出现扩增条带PCR反应的关键环节有模板核酸的

27、制备，引物的质量与特异性，酶的质量及， PCR循环条件。寻找原因亦应针对上述环节进行分析研究。模板：模板中含有杂蛋白质，模板中含有Taq酶抑制剂，模板中蛋白质没有 消化除净，特别是染色体中的组蛋白，在提取制备模板时丢失过多，或吸入酚。模板 核酸变性不彻底。在酶和引物质量好时，不出现扩增带，极有可能是标本的消化处理，模 板核酸提取过程出了毛病，因而要配制有效而稳定的消化处理液，其程序亦应固定不宜随 意更改。酶失活：需更换新酶，或新旧两种酶同时使用，以分析是否因酶的活性丧失或不够 而 导致假阴性。需注意的是有时忘加Taq酶或溴乙锭。引物：引物质量、引物的浓度、两条引物的浓度是否对称，是PCR失败或

28、扩增条带 不 理想、容易弥散的常见原因。有些批号的引物合成质量有问题，两条引物一条浓度高， 一条浓度低，造成低效率的不对称扩增，对策为：选定一个好的引物合成单位。引物 的浓度不仅要看0D值，更要注重引物原液做琼脂糖凝胶电泳，一定要有引物条带出现，而 且两引物带的亮度应大体一致，如一条引物有条带，一条引物无条带，此时做PCR有可能失 败，应和引物合成单位协商解决。如一条引物亮度高，一条亮度低，在稀释引物时要平衡其 浓度。引物应高浓度小量分装保存，防止多次冻融或长期放冰箱冷藏部分，导致引物变质 降解失效。引物设计不合理，如引物长度不够，引物之间形成二聚体等。Mg2+浓度：Mg2+离子浓度对PCR扩

29、增效率影响很大，浓度过高可降低PCR扩增的特 异性，浓度过低则影响PCR扩增产量甚至使PCR扩增失败而不出扩增条带。反应体积的改变：通常进行PCR扩增采用的体积为20ul、30ul、50ul。或lOOul, 应用多大体积进行PCR扩增，是根据科研和临床检测不同目的而设定，在做小体积如20ul 后，再做大体积时，一定要模索条件，否则容易失败。物理原因：变性对 PCR 扩增来说相当重要，如变性温度低，变性时间短， 极有可 能出现假阴性;退火温度过低，可致非特异性扩增而降低特异性扩增效率退火温度过高影响 引物与模板的结合而降低PCR扩增效率。有时还有必要用标准的温度计，检测一下扩增仪或 水溶锅内的变

30、性、退火和延伸温度，这也是PCR失败的原因之一。靶序列变异：如靶序列发生突变或缺失，影响引物与模板特异性结合，或因靶序列 某段缺失使引物与模板失去互补序列，其PCR扩增是不会成功的。假阳性出现的 PCR 扩增条带与目的靶序列条带一致，有时其条带更整齐，亮度更高。引物设计不合适：选择的扩增序列与非目的扩增序列有同源性，因而在进行PCR 扩增时，扩增出的PCR产物为非目的性的序列。靶序列太短或引物太短，容易出现假阳性。 需重新设计引物。靶序列或扩增产物的交叉污染：这种污染有两种原因：一是整个基因组或大片段的 交叉污染，导致假阳性。这种假阳性可用以下方法解决：操作时应小心轻柔，防止将靶序列 吸入加样

31、枪内或溅出离心管外。除酶及不能耐高温的物质外，所有试剂或器材均应高压消毒。 所用离心管及样进枪头等均应一次性使用。必要时，在加标本前，反应管和试剂用紫外线照 射，以破坏存在的核酸。二是空气中的小片段核酸污染，这些小片段比靶序列短，但有一定 的同源性。可互相拼接，与引物互补后，可扩增出PCR产物，而导致假阳性的产生，可用巢 式PCR方法来减轻或消除。出现非特异性扩增带PCR扩增后出现的条带与预计的大小不一致，或大或小，或者同时出现特异性扩增 带 与非特异性扩增带。非特异性条带的出现，其原因：一是引物与靶序列不完全互补、 或 引物聚合形成二聚体。二是Mg2+离子浓度过高、退火温度过低，及PCR循环

32、次数 过多有关。其次是酶的质和量，往往一些来源的酶易出现非特异条带而另一来源的酶则不出现，酶量 过多有时也会出现非特异性扩增。其对策有：必要时重新设计引物。减低酶量或调换另一 来源的酶。降低引物量，适当增加模板量，减少循环次数。适当提高退火温度或采用二温 度点法（93C变性，65C左右退火与延伸）。出现片状拖带或涂抹带PCR扩增有时出现涂抹带或片状带或地毯样带。其原因往往由于酶量过多或酶的质量 差，dNTP浓度过高，Mg2+浓度过高，退火温度过低，循环次数过多引起。其对策有：减少 酶量，或调换另一来源的酶。减少dNTP的浓度。适当降低Mg2+浓度。增加模板量，减 少循环次数。克隆PCR产物1）

33、克隆PCR产物的最优条件是什么？最佳插入片段：载体比需实验确定。1：1（插入片段：载体）常为最佳比，摩尔数比1：8或8： 1也行。应测定比值范围。连接用5ul 2X连接液，50ng质粒DNA,lWeiss单位的T4 连接酶，插入片段共10ul。室温保温1小时，或4C过夜。在这2种温度下，缺T-凸出端 的载体会自连，产生蓝斑。室温保温1小时能满足大多数克隆要求，为提高连接效率，需4C 过夜。2）PCR产物是否需要用凝胶纯化？如凝胶分析扩增产物只有一条带，不需要用凝胶纯化。如可见其他杂带，可能是积累了 大量引物的二聚体。少量的引物二聚体的摩尔数也很高，这会产生高比例的带有引物二聚体 的克隆，而非目

34、的插入片段。为此需在克隆前做凝胶纯化。3）如果没有回收到目的片段，还需要作什么对照实验？A）涂布未转化的感受态细胞。如有菌落，表明氨苄失效，或污染上带有氨苄抗型的质粒，或产生氨苄抗型的菌落。B）转化完整质粒，计算菌落生长数，测定转化效率。例如，将1ug/ul质粒1:100稀释，1ul用于100ul感受态细胞转化。用SOC稀释到lOOOul 后，用1 OOul铺板。培养过夜，产生1000个菌落。转化率为：产生菌落的总数/铺板DNA 的总量。铺板DNA的总量是转化反应所用的量除以稀释倍数。具体而言转化用lOngDNA，用SOC 稀释到1 OOOu后含10 ng DNA，用1/10铺板，共用1 ng

35、 DNA。转化率为：1000 克隆 X10 （3 次方）ng /铺板 1 ng DNA ug=10 （6 次方）cfu/ ug 转化pGEM-T应用10 （8次方）cfu/ ug感受态细胞 如没有菌落或少有菌落，感受态细胞的转化率太低。C）如用pGEM-T正对照，或PCR产物，产生20-40蓝斑（用指定步骤10 （8次方）cfu/ ug感受态细胞），表明载体失去To可能是连接酶污染了核酸酶。T4 DNA连接酶（M1801，M1804，M1794）质量标准好无核酸酶污染，不应用其它来源的 T4 DNA连接酶替换。D）用pGEM-T或pGEM-T Easy载体，连接pGEM-T正对照，转化高频率感

36、受态细胞（10 （8次方）cfu/ug）,按照指定的实验步骤，可得100个菌落，其中60%应为白斑,如产生20-40蓝斑，没有菌落或少有菌落，连接有问题。4）对照实验结果好，却没有回收到目的片段，实验出了什么问题？A）连接用室温保温1小时，能满足大多数克隆，为提高效率，需4C过夜。B）插入片段带有污染，使3-T缺失，或抑制连接，抑制转化。为此，将插入片段和 pGEM-T正对照混合，再连接。如降低了对照的菌落数，插入片段需纯化，或重新制备。如 产生大量的蓝斑，插入片段污染有核酸酶，使pGEM-T或pGEM-T Easy载体3-T缺失。C）插入片段不适于连接。用凝胶纯化的插入片段，因受UV过度照射

37、，时有发生。UV 过度照射会产生嘧啶二聚体，不利于连接，DNA必需重新纯化。D）带有修复功能的耐热DNA聚合酶的扩增产物末端无A，后者是pGEM-T或pGEM-T Easy 载体克隆所需。加Taq DNA聚合酶和核苷酸可在末端加A。详情查pGEM-T pGEM-T Easy载 体技术资料（TM042）oE）高度重复序列可能会不稳定，在扩增中产生缺失和重排，如发现插入片段高频率地 产生缺失和重排，需用重组缺陷大肠杆菌菌株，如SURE细胞PCR反应体系与反应条件标准的PCR反应体系：10X扩增缓冲液10ul4种dNTP混合物各 200umol/L引物各 10lOOpmol模板DNA0.12ugTa

38、q DNA聚合酶2.5uMg2+1.5mmol/L加双或三蒸水至 100ulPCR反应五要素：参加PCR反应的物质主要有五种即引物、酶、dNTP、模板和Mg2+引物：引物是PCR特异性反应的关键，PCR产物的特异性取决于引物与模板DNA 互补的程度。理论上，只要知道任何一段模板DNA序列，就能按其设计互补的寡核苷酸链 做引物，利用PCR就可将模板DNA在体外大量扩增。设计引物应遵循以下原则： 引物长度：15-30bp,常用为20bp左右。 引物扩增跨度：以200-500bp为宜，特定条件下可扩增长至10kb的片段。 引物碱基：G+C含量以40-60%为宜，G+C太少扩增效果不佳，G+C过多易出

39、现非特异 条带。ATGC最好随机分布，避免5个以上的嘌吟或嘧啶核苷酸的成串排列。 避免引物内部出现二级结构，避免两条引物间互补，特别是3端的互补，否则会形 成引物二聚体，产生非特异的扩增条带。 引物3端的碱基，特别是最末及倒数第二个碱基，应严格要求配对，以避免因末端 碱基不配对而导致PCR失败。 引物中有或能加上合适的酶切位点，被扩增的靶序列最好有适宜的酶切位点，这对 酶切分析或分子克隆很有好处。 引物的特异性：引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性。引物量：每条 引物的浓度0.11 umol或10100pmol,以最低引物量产生所需要的结果为好，引物浓度 偏高会引起错配和非特异性扩增，

40、且可增加引物之间形成二聚体的机会。做配药品，稀释引物，PCR实验中，对水的要求要很高么？配制一般化学试剂使用二级水即可。配制生化试剂，包括引物稀释、PCR所用水，以及转膜、核酸抽提等，必须使用二次蒸 馏水或一级水。1 PCR引物设计的原则引物设计有3条基本原则：首先引物与模板的序列要紧密互补，其次引物与引物之间 避免形成稳定的二聚体或发夹结构，再次引物不能在模板的非目的位点引发DNA聚合反应 (即错配)。具体实现这3条基本原则需要考虑到诸多因素，如引物长度(primer leng th),产物 长度(product leng th),序列Tm值(mel ting tempera ture)，引

41、物与模板形成双链的内 部稳定性(internal stability,用∆G值反映)，形成引物二聚体(primer dimer)及 发夹结构(duplex forma tion and hairpi n)的能值，在错配位点(false priming site) 的引发效率，引物及产物的GC含量(composition)，等等。必要时还需对引物进行修饰, 如增加限制性内切酶位点，引进突变等。根据有关参考资料和笔者在实践中的总结，引物设 计应注意如下要点：1. 引物的长度一般为15-30 bp，常用的是18-27 bp，但不应大于38,因为过长会导 致其延伸温度大于74C，不适于Ta

42、q DNA聚合酶进行反应2。2. 引物序列在模板内应当没有相似性较高，尤其是3端相似性较高的序列，否则容 易导致错配。引物3端出现3个以上的连续碱基，如GGG或CCC，也会使错误引发机率增 加2。3. 引物3端的末位碱基对Taq酶的DNA合成效率有较大的影响。不同的末位碱基在 错配位置导致不同的扩增效率，末位碱基为A的错配效率明显高于其他3个碱基，因此应 当避免在引物的3端使用碱基A34。另外，引物二聚体或发夹结构也可能导致PCR反 应失败。5端序列对PCR影响不太大，因此常用来引进修饰位点或标记物2。4. 引物序列的GC含量一般为40-60%,过高或过低都不利于引发反应。上下游引物的 GC含

43、量不能相差太大25。5. 引物所对应模板位置序列的Tm值在72C左右可使复性条件最佳Tm值的计算有多 种方法，如按公式Tm=4(G+C)+2(A+T)，在Oligo软件中使用的是最邻近法(the nearest neighbor method) 67。6. ∆G值是指DNA双链形成所需的自由能，该值反映了双链结构内部碱基对的 相对稳定性。应当选用3端∆G值较低（绝对值不超过9）,而5端和中间& #8710;G 值相对较高的引物。引物的3端的∆G值过高，容易在错配位点形成双链结构并引 发DNA聚合反应6。7. 引物二聚体及发夹结构的能值过高（超过4.5kcal

44、/mol）易导致产生引物二聚体 带，并且降低引物有效浓度而使PCR反应不能正常进行8。&对引物的修饰一般是在5端增加酶切位点，应根据下一步实验中要插入PCR产物 的载体的相应序列而确定。值得一提的是，各种模板的引物设计难度不一。有的模板本身条件比较困难，例如GC 含量偏高或偏低，导致找不到各种指标都十分合适的引物；在用作克隆目的的PCR因为产 物序列相对固定，引物设计的选择自由度较低。在这种情况只能退而求其次，尽量去满足条 件。2扩增较大片段DNA的PCR方法一般PCR方法在扩增大片段DNA时的局限性：通常所用的PCR方法都在两个方面有局限，即目标产物精确程度和合成片段的大小。Pfu（Pyro

45、coccus furiosus）DNA聚合酶，具有完整的3外切酶校读活性（3-editing-exonuclease） ，可以将每个循环中碱基的错配率由10*-4降到10*-3，从而 提高PCR产物的准确性。但它在扩增片段时，效率比Klentaq l（Taq DNA聚酶 N-末端缺失突变体，类似于E.coli DNA聚合酶I Klenow片段）或AmpliTaq （全长的Taq DNA 聚合酶）等聚合酶差；在扩增片段时亦不比各种形式的Taq DNA聚合酶（如Ampli Taq、Klentaq 1、Klentaq 5等N-末端缺失的变异株）有明显优越之处。因而以往的PCR 反应产物限制在5.0k

46、b以内。超出这一范围，PCR扩增反应效率将明显下降，同时产物会降 解。即使将延伸时间定为30分钟（10倍于通常所需）亦无改进。利用两种DNA聚合酶进行较大片段DNA的扩增美国华盛顿大学医学院的Barnes WM等对前述问题进行了深入系统的研究，认为：PCR 反应效率低最主要的原因是由于错配的碱基阻碍了延伸反应的正常进行，Pfu DNA聚合酶虽 然可以通过“校读”功能纠正错配的碱基，但亦可能降解引物，尤其是在较长反应时间下； 酶浓度较高时，反应效果更差。因此必需将Pfu DNA聚合酶的浓度控制在较低状态，同时配 合使用Klentaq l等DNA聚合酶，这样既可以有效地去除错配，又可以使Klent

47、aq l等催化 的延伸反应顺畅进行。实验证实，按15:1的比例混合使用Klentaq l和Pfu DNA聚合酶， 引物大小为27-33nt,即可使反应有效进行。当然，对于各种不同条件的反应，两种类型酶 的最佳配比需要具体考虑。控制脱嘌呤反应增强扩增效率在PCR反应体系中某些成分耐热性较差，会影响反应效率。DNA聚合酶的热稳定性一般 都是较好的，可能是模板DNA在温度较高的环境中某些位点发生脱嘌吟反应从而阻碍反应的 顺利进行。Lindahl和Nyberg的研究结果显示：在70C pH7.4的条件下，单链DNA脱嘌 吟 反应的速度是双链DNA的4倍；100C pH7.0时，lOOkb的碱基中每分钟

48、将有1个位点脱嘌 吟。这一反应与缓冲体系中酸碱度的变化有关。人们注意到：三羟甲基氨基甲烷Tris）的 酸解离常数（pKa）会随温度升高而改变，平均每升高1C, pKa值降低0.03。因而，在25C 时pH8. 55的PCR反应体系，到95C热变性时，pH值将变为6.45，这就很可能诱导脱嘌吟 反应。为了解决这一问题，可以采取下列措施：缩短热变性时间，Barnes等在扩增35kb的大片段时，变性条件为95C5秒，取得满 意结果；尽可能使升温、降温过程缩短，可选择使用导热性能优越的薄壁反应管及较为先进的 扩增设备；适当提高反应体系的pH值，反应最初应控制在pH8. 8-9.2范围；适当增加延伸时间

49、（可长至20分钟）。使用这种方法可以扩增最大为35kb的DNA片 段,产物的准确性亦有充分保证，克服了以往基因克隆过程中出现的DNA分子内的碱基重排 和可能的毒性危险等问题。酶及其浓度目前有两种Taq DNA聚合酶供应，一种是从栖热水生杆菌中提纯的天然 酶，另一种为大肠菌合成的基因工程酶。催化一典型的PCR反应约需酶量2。5U（指总反应 体积为100ul时），浓度过高可引起非特异性扩增，浓度过低则合成产物量减少。dNTP的质量与浓度dNTP的质量与浓度和PCR扩增效率有密切关系，dNTP粉呈颗粒状， 如保存不当易变性失去生物学活性dNTP溶液呈酸性，使用时应配成高浓度后，以1MNa0H 或1M

50、 Tris。HCL的缓冲液将其PH调节到7.07.5,小量分装，-20C冰冻保存。多次冻 融会使dNTP降解。在PCR反应中，dNTP应为50200umol/L,尤其是注意4种dNTP的浓度 要相等（ 等摩尔配制），如其中任何一种浓度不同于其它几种时（偏高或偏低），就会引起错 配。浓度过低又会降低PCR产物的产量。dNTP能与Mg2+结合，使游离的Mg2+浓度降低。模板（靶基因）核酸 模板核酸的量与纯化程度，是PCR成败与否的关键环节之一，传统 的DNA纯化方法通常采用SDS和蛋白酶K来消化处理标本。SDS的主要功能是：溶解细胞 膜上的脂类与蛋白质，因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜，并解离细胞中的核

51、蛋白，SDS还能与 蛋白质结合而沉淀；蛋白酶K能水解消化蛋白质，特别是与DNA结合的组蛋白，再用有机 溶剂酚与氯仿抽提掉蛋白质和其它细胞组份，用乙醇或异丙醇沉淀核酸。提取的核酸即可作 为模板用于PCR反应。一般临床检测标本，可采用快速简便的方法溶解细胞，裂解病原体, 消化除去染色体的蛋白质使靶基因游离，直接用于PCR扩增。RNA模板提取一般采用异硫氰 酸胍或蛋白酶K法，要防止RNase降解RNA。Mg2+浓度Mg2+对PCR扩增的特异性和产量有显著的影响，在一般的PCR反应中，各种 dNTP浓度为200umol/L时，Mg2+浓度为1.52.0mmol/L为宜。Mg2+浓度过高，反应特异性 降

52、低，出现非特异扩增，浓度过低会降低Taq DNA聚合酶的活性，使反应产物减少。PCR反应条件的选择PCR反应条件为温度、时间和循环次数。温度与时间的设置：基于PCR原理三步骤而设置变性-退火-延伸三个温度点。在标准 反应中采用三温度点法，双链DNA在9095C变性，再迅速冷却至4060C,引物退火并 结合到靶序列上，然后快速升温至7075C，在Taq DNA聚合酶的作用下，使引物链沿模 板延伸。对于较短靶基因（长度为100300bp时）可采用二温度点法，除变性温度外、退火 与延伸温度可合二为一，一般采用94C变性，65C左右退火与延伸（此温度Taq DNA酶仍有 较高的催化活性）。 变性温度与

53、时间：变性温度低，解链不完全是导致PCR失败的最主要原因。一般情 况下，93C94Clmin足以使模板DNA变性，若低于93C则需延长时间，但温度不能过高， 因为高温环境对酶的活性有影响。此步若不能使靶基因模板或PCR产物完全变性，就会导致 PCR失败。 退火（复性）温度与时间：退火温度是影响PCR特异性的较重要因素。变性后温度快 速冷却至40C60C，可使引物和模板发生结合。由于模板DNA比引物复杂得多，引物和 模板之间的碰撞结合机会远远高于模板互补链之间的碰撞。退火温度与时间，取决于引物的 长度、碱基组成及其浓度，还有靶基序列的长度。对于20个核苷酸，G+C含量约50%的引物，55C为选择

54、最适退火温度的起点较为理想。引物的复性温度可通过以下公式帮助选择合适的 温度：Tm 值(解链温度)=4(G+C) +2(A+T)复性温度=Tm值-(510C)在Tm值允许范围内，选择较高的复性温度可大大减少引物和模板间的非特异性结合, 提高PCR反应的特异性。复性时间一般为3060sec,足以使引物与模板之间完全结合。 延伸温度与时间：Taq DNA聚合酶的生物学活性：7080C 150核苷酸/S/酶分子70C 60核苷酸/S/酶分子55C 24核苷酸/S/酶分子高于90C时，DNA合成几乎不能进行。一、RT-PCR1. cDNA产量的很低 可能的原因：*RNA模板质量低*对mRNA浓度估计过

55、高*反应体系中存在反转录酶抑制剂或反转录酶量不足*同位素磷32过期*反应体积过大，不应超过50ul2. 扩增产物在电泳分析时没有条带或条带很浅*最常见的原因在于您的反应体系是PCR的反应体系而不是RT-PCR的反应体系*与反应起始时RNA的总量及纯度有关*建议在试验中加入对照RNA*第一链的反应产物在进行PCR扩增时，在总的反应体系中的含量不要超过1/10*建议用0ligo(dT)或随机引物代替基因特异性引物(GSP)用于第一链合成。由于RNA 模板存在二级结构，如环状结果，有可能导致GSP无法与模板退火；或SSII反转录酶无法 从此引物进行有效延伸。*目的mRNA中含有强的转录中止位点，可以

56、试用以下方法解决：a.将第一链的反应温度提高至50C。b.使用随机六聚体代替0ligo(dT)进行第一链反应。3. 产生非特异性条带*用RT阴性对照检测是否被基因组DNA污染。如果RT阴性对照的PCR结果也显示同样 条带，则需要用DNase I重新处理样品。*在PCR反应中，非特异的起始扩增将导致产生非特异性结果。在低于引物Tm2至5C 的温度下进行退火，降低镁离子或是目的DNA的量将减少非特异性结果的产生。*由于mRNA剪切方式的不同，根据选择引物的不同将导致产生不同的RT-PCR结果。4. 产生弥散(smear)条带*在PCR反应体系中第一链产物的含量过高*减少引物的用量*优化PCR反应条

57、件/减少PCR的循环次数*在用DNase处理被DNA污染的RNA样品时，其产生的寡核苷酸片段会产生非特异性扩 增，一般会显示为弥散背景。5. 产生大分子量的弥散条带 *大多数情况下是由于退火温度过低而导致的非特异性的起始及延伸产生的*对于长片段的PCR，建议将反应体系中cDNA的浓度稀释至1:10 (或1:100-1:200)6. 在无反转录酶的情况下，对照RNA获得扩增结果*通常是由于对照RNA中含有痕量DNA而导致的。由于进行体外转录时不可能将所有的 DNA模板消除。建议可将第一链cDNA稀释1:10、1:100、1:1000倍以消除DNA污染所造成 的影响。*有可能是引物二聚体的条带7.

58、 扩增产物滞留在加样孔中*有可能是由于模板量过高而导致PCR结果产生了高分子量的DNA胶状物。建议将第 一链结果至少稀释100倍再进行二次扩增。*另外，在二次PCR时使用的退火温度如果比引物的Tm值低5C,可以将退火温度适当 增高或进行热启动以提高特异性。& SSIII与SSII有何不同？*具有更咼的热稳定性(达50C)*具有更长的半衰期（达220分钟）*对PCR无抑制*干冰运输*Tdt活性更低SuperScrip till反转录酶9. 为什么有人更喜欢用SSIII而不是ThermoScript?ThermoScript如果保存不当会引起活性很快降低，SSIII则更稳定。10. 为什么使用基因

59、特异性引物（GSP）?GSP在扩增低丰度的转录本时是最好的。OligodT引物建议用于高质量RNA及全长转录 本的逆转录；随机引物用于mRNA片段的逆转录。11. 什么情况下需要使用RNase H?在第一轮PCR中RNA/DNA杂合体不能正常变性时12. 根据不同的目的选择不同的系统：目的建议RT与PCR使用不同的引物或需要灵活选择PCR DNA聚合酶两步法RT-PCR系统高灵敏度一步法或两步法RT-PCR系统高特异性含有适当的DNA聚合酶的两步法RT-PCR系统或具有高保真Platinum Taq酶的一步法RT-PCR系统高保真度含有Pfx Taq酶的两步法RT-PCR系统长的反转录结果通常

60、使用两步法RT-PCR系统可达到最佳结果含Elongase酶的一步法RT-PCR系统二、Generacer1. 如何针对Generacer试剂盒设计基因特异性引物（GSP）?使用5或3RACE试剂都需要至少一条基因特异性引物，您在设计引物时需要注意以 下几点要求：*50-70%的GC含量，以提高引物熔点（Tm）*23-28个碱基长度，以提高引物特异性*降低3端GC含量，将引物非特异性结合的可能性降至最低2. 为什么得不到RACE产物？*加入Hela对照*低质量的RNA模板*逆转录失败，SSII和SSIII非常适用于长模板cDNA的合成*目的基因丰度太低，可以通过提高PCR的循环次数来解决，建议

61、使用巢式PCR*目的基因没有表达，可以通过使用两条GSPs来分析cDNA中是否含有目的基因*1目的基因太长而不适合进行反转录，建议使用GeneRacer试剂盒中的Oligo dT来得到 全长cDNA，使用随机引物或与模板的5端尽可能近的GSP进行PCR。*cDNA模板属于困难模板，可以通过以下方法解决：优化PCR反应参数及反应体系；降 低退火温度；使用5-10%的DMS0帮助通过高GC含量区；使用高保真度和高延伸能力的酶 进行PCR反应。3. RACE的PCR结果有杂带RACE PCR杂带或非特异性PCR条带可能是由于以下原因：*GSP与其他cDNA的非特异性结合会导致在扩增目的产物时得到无关

62、产物。*GeneRacer引物和cDNA的非特异性结合会导致产生一端带有GeneRacer引物序列的 PCR产物。*RNA降解。*PCR管或试剂污染。注意：杂带一般是因为没有优化PCR条件，可以加入阴性对照来确定。4. 得不到全长的5RACE PCR产物*CIP反应后的RNA降解产生了新的带有5磷酸的断裂模板，可以同GeneRacer RNAOligo连接。一定要小心操作，保证RNA无降解。*CIP脱磷酸不完全，可以增加反应中CIP的量或减少RNA的量。*PCR产生了杂带，并不是真正的连接产物，可以使用上述建议优化PCR。三、PCR在进行PCR时：*请确保您没有使用过量的起始DNA或者过高浓度

63、的引物，也没有加入过量的Mg+*请确保您使用了恰当的退火温度*请确保您没有使用过量的DNA聚合酶四、引物1. 应该选择哪种纯化方法？取决于实验目的和引物的长度2. 为什么我订购了 50nmol，但是收到却只有40nmol?50nmol是起始量3. 怎样制备100卩M的储液？体积（卩1）=质检报告上的nmol数目X104. 怎样设计引物？*一般长度 20-30bp；*至少50%的GC含量；*避免引物二聚体和二级结构；*引物对的Tm值应该接近。5. 引物序列有插入或缺失？*使用上游和下游引物多测几个克隆。*请选择正确的纯化方法。6. PCR无结果？*请检查引物设计是否正确；*请检测0D读数是否正确；*做一个阳性对照和一个阴性对照。