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1、会计学1ELISA原理方法原理方法(fngf)操作及注意事项操作及注意事项第一页，共58页。第1页/共58页第二页，共58页。 ELISA法是免疫诊断中的一项技术，现已成功地法是免疫诊断中的一项技术，现已成功地应用于多种病原微生物所引起的传染病、寄生虫病及应用于多种病原微生物所引起的传染病、寄生虫病及非传染病等方面非传染病等方面(fngmin)的免疫诊断。也已应用于的免疫诊断。也已应用于大分子抗原和小分子抗原的定量测定，根据已经使用大分子抗原和小分子抗原的定量测定，根据已经使用的结果，认为的结果，认为ELISA法具有灵敏、特异、简单、快速法具有灵敏、特异、简单、快速、稳定及易于自动化操作等特点
2、。不仅适用于临床标、稳定及易于自动化操作等特点。不仅适用于临床标本的检查，而且由于一天之内可以检查几百甚至上千本的检查，而且由于一天之内可以检查几百甚至上千份标本份标本,因此，也适合于血清流行病学调查。本法不因此，也适合于血清流行病学调查。本法不仅可以用来测定抗体，而且也可用于测定体液中的循仅可以用来测定抗体，而且也可用于测定体液中的循环抗原，所以也是一种早期诊断的良好方法。环抗原，所以也是一种早期诊断的良好方法。第2页/共58页第三页，共58页。用于临床检验的ELISA主要(zhyo)有以下几种类型：双抗体夹心双抗体夹心(jixn)法测抗原法测抗原双抗原夹心法测抗体双抗原夹心法测抗体间接法法
3、测抗体间接法法测抗体竞争法测抗体竞争法测抗体捕获包被法测抗体捕获包被法测抗体ABS-ELISA法法竞争法测抗原竞争法测抗原第3页/共58页第四页，共58页。 双抗体夹心法适用于测定二价或双抗体夹心法适用于测定二价或二价以上的大分子二价以上的大分子(fnz)抗原，抗原，但不适用于测定半抗原及小分子但不适用于测定半抗原及小分子(fnz)单价抗原，因其不能形成单价抗原，因其不能形成两位点夹心。两位点夹心。 第4页/共58页第五页，共58页。第5页/共58页第六页，共58页。第6页/共58页第七页，共58页。第7页/共58页第八页，共58页。第8页/共58页第九页，共58页。第9页/共58页第十页，共
4、58页。 Title in here第10页/共58页第十一页，共58页。 Title in here第11页/共58页第十二页，共58页。 Title in here第12页/共58页第十三页，共58页。 Title in here第13页/共58页第十四页，共58页。 Title in here第14页/共58页第十五页，共58页。第15页/共58页第十六页，共58页。 Title in here第16页/共58页第十七页，共58页。 Title in here第17页/共58页第十八页，共58页。 Title in here第18页/共58页第十九页，共58页。 ABS为亲和素为亲和素(
5、avidin)生物素生物素(biotin)系系统统(system)的略语的略语(ly)。生物素与亲和素。生物素与亲和素的结合具有很强的特异性，其亲和力较抗原的结合具有很强的特异性，其亲和力较抗原抗体反应大得多，两者一经结合就极为稳定抗体反应大得多，两者一经结合就极为稳定。由于一个亲和素可与。由于一个亲和素可与 4个生物素分子结合个生物素分子结合，因此如把，因此如把ABS与与ELISA法可分为酶标记亲法可分为酶标记亲和素和素-生物素（生物素（LAB）法和桥联亲和素）法和桥联亲和素-生物生物素（素（ABC）法两种类型。两者均以生物素标）法两种类型。两者均以生物素标记的抗体（或抗原）代替原记的抗体（
6、或抗原）代替原ELISA系统中的系统中的酶标抗体（抗原）。酶标抗体（抗原）。第19页/共58页第二十页，共58页。 Title in here第20页/共58页第二十一页，共58页。在临床检验中一般采用商品试剂盒进行测定。在临床检验中一般采用商品试剂盒进行测定。 完整的完整的ELISA试剂盒包含以下各组分：试剂盒包含以下各组分：（1）已包被抗原或抗体的固相载体（免疫吸附剂）；）已包被抗原或抗体的固相载体（免疫吸附剂）；（2）酶标记的抗原或抗体（结合物）；）酶标记的抗原或抗体（结合物）；（3）酶的底物；）酶的底物；（4）阴性对照）阴性对照(duzho)品和阳性对照品和阳性对照(duzho)品（定
7、性测定中），参考标准品和控制血清品（定性测定中），参考标准品和控制血清（定量测定中）；（定量测定中）；（5）标本的稀释液；）标本的稀释液；（6）洗涤液；）洗涤液；（7）酶反应终止液。）酶反应终止液。第21页/共58页第二十二页，共58页。一、加样一、加样在在ELISA中一般有中一般有3次加样步聚，即加次加样步聚，即加标本，加酶结合物，标本，加酶结合物，液和底物应用液时可液和底物应用液时可用定量多道加液器，用定量多道加液器，使加液过程迅速完成。使加液过程迅速完成。第22页/共58页第二十三页，共58页。第23页/共58页第二十四页，共58页。第24页/共58页第二十五页，共58页。第25页/共5
8、8页第二十六页，共58页。第26页/共58页第二十七页，共58页。（3）第27页/共58页第二十八页，共58页。第28页/共58页第二十九页，共58页。第29页/共58页第三十页，共58页。第30页/共58页第三十一页，共58页。二、保温二、保温在在ELISA中一般有中一般有两次抗原抗体反应，两次抗原抗体反应，即加标本和加酶结合即加标本和加酶结合物。抗原抗体反应的物。抗原抗体反应的完成需要有一定的温完成需要有一定的温度和时间，这一保温度和时间，这一保温过程过程(guchng)称为称为温育温育(incubation)。这是一个逐步平衡的这是一个逐步平衡的过程过程(guchng)，因，因此需经扩散
9、才能达到此需经扩散才能达到反应的终点。在其后反应的终点。在其后加入的酶标记抗体与加入的酶标记抗体与固相抗原的结合也同固相抗原的结合也同样如此。这就是为什样如此。这就是为什么么ELISA反应总是需反应总是需要一定时间的温育。要一定时间的温育。第31页/共58页第三十二页，共58页。第32页/共58页第三十三页，共58页。第33页/共58页第三十四页，共58页。三、洗涤三、洗涤第34页/共58页第三十五页，共58页。第35页/共58页第三十六页，共58页。第36页/共58页第三十七页，共58页。第37页/共58页第三十八页，共58页。四、显色和四、显色和比色比色显色显色显色是显色是ELISA中中的
10、最后一步温育反应，的最后一步温育反应，此时酶催化无色的底此时酶催化无色的底物生成有色的产物。物生成有色的产物。反应的温度和时间是反应的温度和时间是时间一般不需要严格时间一般不需要严格控制，有时可根据阳控制，有时可根据阳性对照性对照(duzho)孔和孔和阴性对照阴性对照(duzho)孔孔的显色情况适当缩短的显色情况适当缩短或延长反应时间，及或延长反应时间，及时判断。时判断。第38页/共58页第三十九页，共58页。第39页/共58页第四十页，共58页。第40页/共58页第四十一页，共58页。第41页/共58页第四十二页，共58页。第42页/共58页第四十三页，共58页。第43页/共58页第四十四页
11、，共58页。结果判断结果判断定性测定定性测定定性测定的结果定性测定的结果判断是对受检标本中判断是对受检标本中是否含有是否含有(hn yu)待待测抗原或抗体作出测抗原或抗体作出“有有”或或“无无”的简的简单回答，分别用单回答，分别用“阳阳性性”、“阴性阴性”表示。表示。“阳性阳性”表示该标本表示该标本在该测定系统中有反在该测定系统中有反应。应。“阴性阴性”则为无则为无察不稀释标本呈色的察不稀释标本呈色的深浅判断为强阳性、深浅判断为强阳性、弱阳性更具定量意义。弱阳性更具定量意义。在间接法和夹心在间接法和夹心法法ELSIA中，阳性孔中，阳性孔呈色深于阴性孔。在呈色深于阴性孔。在竞争法竞争法ELISA
12、中则相中则相反，阴性孔呈色深于反，阴性孔呈色深于阳性孔。两类反应的阳性孔。两类反应的结果判断方法不同，结果判断方法不同，分述于下。分述于下。第44页/共58页第四十五页，共58页。第45页/共58页第四十六页，共58页。第46页/共58页第四十七页，共58页。第47页/共58页第四十八页，共58页。第48页/共58页第四十九页，共58页。第49页/共58页第五十页，共58页。b. 抑制(yzh)率法抑制(yzh)率表示第50页/共58页第五十一页，共58页。加样应用微量移液器（加样枪加样应用微量移液器（加样枪)按规定的量加入微孔板的按规定的量加入微孔板的1/3处避免加在孔壁上部，并注意不可溅出
13、，不可产生气泡。处避免加在孔壁上部，并注意不可溅出，不可产生气泡。每次加样应更换吸嘴，做到一人一吸头，以免发生交叉污染每次加样应更换吸嘴，做到一人一吸头，以免发生交叉污染。样本稀释，目的是为了减少非特异性反应，所以一定要先加样本稀释，目的是为了减少非特异性反应，所以一定要先加稀释液后加样本，特别稀释液后加样本，特别(tbi)注意加样后要在微量振荡器上振注意加样后要在微量振荡器上振荡荡30秒钟，同时注意防止液体溢出。操作步骤中加二种以上试秒钟，同时注意防止液体溢出。操作步骤中加二种以上试剂时均需振荡混匀。剂时均需振荡混匀。 如用滴瓶滴加试剂应先将滴瓶摇匀并挤去第一滴有气泡的试如用滴瓶滴加试剂应先将滴瓶摇匀并挤去第一滴有气泡的试剂后加样。剂后加样。 第51页/共58页第五十二页，共58页。第52页/共58页第五十三页，共58页。第53页/共58页第五十四页，共58页。第54页/共58页第五十五页，共58页。第55页/共58页第五十六页，共58页。第56页/共58页第五十七页，共58页。n) 命苦不怨政府第57页/共58页第五十八页，共58页。
ELISA原理方法操作及注意事项学习教案
