小麦生理参数测定方法

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1、叶绿素含量测定原理叶绿素约占总干重的1%,含a、b、c、d四种，高等植物含a、b两种，光、温度、营养元素氧、水是叶绿素合成的重要环境因子。叶绿素是双羧酸酯，不溶于水，通常用含少量水的有机溶剂如80%的丙酮或95%的乙醇来提取叶片中的叶绿素，这是因为叶绿素与蛋白质结合很牢固，需要经过水解作用才可被提取出来。已知叶绿素a、b的95%乙醇提取液最大吸收峰的波长分别为665nm和649nm，用95%乙醇研磨法和浸泡法提取叶绿素，以提取试剂95%乙醇为对照，用分光光度计分别测定649nm、665nm处的吸光度并计算叶绿素浓度，计算公式为：Ca=13.95D6656.88D649；Cb=24.96D649

2、7.32D665；Ct=Ca+Cb（注：Ca：叶绿素a的含量；Cb:叶绿素b的含量；Ct:总叶绿素的含量）仪器：研钵、25mL容量瓶、漏斗、剪刀、滤纸、722光栅分光光度计、具塞试管试剂：95%乙醇（AR）丙酮（AR）1:1、碳酸钙（AR）、石英砂（AR）实验方法称取小麦叶片0.2g剪碎置于研钵中，加少许CaC03，石英砂、95%乙醇充分研磨，过滤，将滤液移入25mL容量瓶，用95%乙醇（AR）丙酮（AR）1:1反复洗涤残渣、滤纸至无绿色，合并滤液，定容。取上述提取液1mL稀释至10mL，摇匀。以95%乙醇为参照，在分光光度计665nm/649nm下测其光密度。Chia含量（mg/g）=（13

3、.95D665-6.88D649），V/（W-1000）Chib含量（mg/g）=（24.96D6497.32D665）V/（W.1000）式中：A-测定波长下的光密度值V-叶绿素提取液总体积（mL）（若用的稀释液，则应乘以稀释倍数）W材料鲜重（g）含量：mg/g=（浓度*提取体积*稀释倍数）/样品鲜重（植物生理学实验指导李玲）参考文献化学生态学实验指导书-王晗光编写SOD的测定原理：SOD可催化下列反应:S（）DOi+0i+2H+*比0+0：SOD活性可用披清除的OiKttt来表示.核黄素在光卜氧化产生超甄阴萬子脂者町将氮蓝四哇（MBT）还原为蓝也的甲（formazn）,其在560run处有

4、最大吸光度而SOD可清除超楓阴离子从而抑制了甲蒜的形成*所以反应液蓝色愈深说期酶活性愈低，反之騎活性蠱髙。茜色甲麻NBT0,+HA一个蘭活性单位被定文为反应体系NBT的光化还Jg寧为对舸的50%时所用的酶液试占仪器：高速冷冻台式离心机；分光光度计；移液器；光照培养箱；指形管；研钵试剂：1.50mmol/L磷酸缓冲液（pH7.8）2.130mmol/L甲硫氨酸（Met）溶液：称取1.9339gMet用磷酸缓冲液溶解定容至100mL3.7500阔/LNBT（氮蓝四唑）溶液：称取0.06133gNBT用磷酸缓冲液溶解定容至100mL,避光保存4.20卜工馳I核黄素溶液：称取0.0750g核黄素用磷酸

5、缓冲液溶解定容至l00mL，吸取1mL定容至100mL即可，随用随配，避光保存5.100|!mol/LEDTA-Na2溶液：称取0.0372gEDTA-Na22出0，用磷酸缓冲液溶解并定容至100mL，吸取10mL定容至100mL即可。6.SOD提取介质：50mmol/L磷酸缓冲液（pH7.8）内含1%聚乙烯吡咯烷酮（PVP）。（材料）正常生长或经逆境处理的植物组织器官实验方法：1取小麦叶片（去叶脉）0.5g于预冷的研钵中，加1mL磷酸缓冲液在冰浴下研磨成匀浆，倒入10mL刻度试管中，加缓冲液定容为5mL。取2mL于离心管离心20min，上清液即为SOD粗提液。2每个样品取8个洁净干燥的微烧杯

6、（透明度好）编号，按表加入各试剂，反应系统总体积为3mL。其中48号管中磷酸缓冲液和酶液的加入量依样品中的酶活性进行调整，如果酶活性强时，可适当减少酶液用量。试剂全部加入后混匀，将1号杯置于暗处，其余各杯均于25C、4000lx日光灯下反应20min，各管受光情况要一致。温度高时，时间缩短；温度低时，时间延长，然后立即遮光停止反应。反应系统中各试剂用量试剂杯号060mmol，匚Met请液(ml750ptnd*L1100问d*17120/mol*L1WTANa,谐痕mD薛Mt(Mt)蕭慵水（ml-）10,3a3630,30L820.30.30,3S30L830.30*30.30,30L840.3

7、630.30.3JL79550.30.30,30,310L796630,30.30.3151,78570.30.30.30.320L7880+3030+30,325L7?5SOD总活性u/g=70.5AckWVsSOD总活性SOD比活性u/mg=蛋白质含量在560nm波长下，以1号杯调零，测定其余各杯反应体系的吸光度。以2、3号杯吸光度的平均值作为还原率的100%，分别计算不同酶液量抑制NBT光还原的相对百分率。以酶液用量（pL）为横坐标，以NBT光化还原的抑制率（%）为纵坐标绘制二者相关曲线，NBT光化还原被抑制50%的酶液量为一个酶活单位。Ack:照光对照管的吸光度Ae:样品管的吸光度Vt

8、:样品液总体积（ml）W:样品鲜重（g）Vs:测定时样品用量（g）参考文献植物生理学实验教程-张立军，樊金娟主编2007基础生物学实验教程-王德良，周小慧主编2006POD的测定原理：过氧化物酶是植物体内普遍存在的、活性较高的一种酶，它与呼吸作用、光合作用及生长素的氧化等都有密切关系。在植物生长发育过程中，它的活性不断发生变化。因此测量这种酶，可以反映某一时期植物体内代谢的变化。在有过氧化氢存在的条件下，过氧化物酶能使愈创木酚氧化，生成茶褐色物质。该物质在470nm处有最大吸收，可用分光光度计测量470nm处的吸光度变化速率来测定过氧化物酶的活性。仪器：研钵，恒温水浴锅，25mL容量瓶，吸管，

9、高速冷冻离心机，秒表，磁力搅拌器试剂：1愈创木酚2.30%过氧化氢。3.100mmol/L,磷酸缓冲液（pH6.0）4反应混合液：取100mmol/L磷酸缓冲液（pH6.0）50mL于烧杯中，加入愈创木酚28丛,于磁力搅拌器上加热搅拌，直至愈创木酚完全溶解，待溶液冷却后，加入30%过氧化氢19L,混合均匀，保存于冰箱中备用实验方法：1称取新鲜小麦叶片0.1g，剪碎，放入预冷的研钵中，加入适量预冷的磷酸缓冲液冰浴研磨成匀浆。残渣再用5mL磷酸缓冲液提取一次，合并两次匀浆液，以4000rpm低温离心15min,上清液即为粗酶液，定容至25mL，酶液贮于低温下备用。2取2支试管，于1支中加入反应混合

10、液3mL。和磷酸缓冲液1mL,作为对照，另1支中加入反应混合液3mL,和上述酶液1mL。（如酶活性过高可稀释之）。迅速将两支试管中溶液混匀后，倒人比色杯，置于分光光度计样品室内，立即开启秒表记录时间，于470nm处测定吸光度（OD）值，每隔30s读数一次。3以每分钟OD变化值旳47。/（gFwmin）表示酶活性大小，也可以用每分钟OD值变化0.01作为1个过氧化物酶活性单位（U）表示。过氧化物酶活性U/（gFwmin）=鹹。式中：朋470-反应时间内OD变化值Vt-提取酶液总体积（mL）W-植物鲜重（g）Vs-测定时取用酶液体积（mL）t-反应时间（min）参考文献：植物生物学实验-常福辰，陆

11、长梅，沙莎主编2007植物生理学实验技术-张治安，陈展宇主编2008植物生理学实验技术-孔祥生，易现峰主编2008式中:A4h血1+Ay?JA一240X旳OlxxtxFWCAT的测定（紫外吸收法）原理H2O2对240nm波长的紫外光具有强吸收作用，过氧化氢酶（CAT）能催化H2O2分解成H?0和。2,因此在反应体系中加入CAT时会使反应液的吸光度（A240）随反应时间降低，根据A240的变化速率可计算出CAT的活性。仪器：紫外分光光度计、恒温水浴、冷冻离心机、电子天平、100mL移液枪2支、10mL试管4支、5mL、2mL、ImL移液管各1支、25mL容量瓶、10mL具塞试管、剪刀、研钵试剂：

12、1.150mmol/L磷酸缓冲液（pH7.8）（内含1%PVP）2.100mmol/LH2O2溶液（取30%H2O22.8mL用磷酸缓冲液定容到250mL，现配现用避光保持）实验方法1酶液提取称剪碎混匀的小麦叶片1.00g置于预冷的研钵中，加适量磷酸缓冲液及少量石英砂，在冰浴上研磨匀浆，转移至25mL容量瓶中，用磷酸缓冲液冲洗研钵23次（每次I一2mL），合并冲洗液于容量瓶中，定容至25mL,摇匀。取提取液5mL于离心管中，在4C、15000rgm下离心15min，上清液即为酶提取液，4C下保存备用。2. CAT活性的测定 取10mL具塞试管，加2mL酶提取液于沸水浴中加热煮致失活，冷却备用

13、取10mL试管4支，3支为测定（3个重复），1支为对照，按下表加入试剂。试剂(mL)试管号1234（对照Tris-HClpH7.01.01,01.0LO认L6】0.1英ts水1.71.7J.7J.7 将上述4支试管于25C水浴中预热3min后，逐管加入0.2mL100mmol/LH2O2溶液，每加一管立即在紫外分光光度上测定A24o（蒸馏水调零），每隔30s读数一次，共测4min,记录4支试管的测定值。3结果计算以Imin内A240降低0.1（3支测定管的平均值）为一个酶活性单位（U）,先求出3支测定管各自每分钟A240降低值，按下式汁算CAT活性11CAT活性（Ug-FWmin-）A为对照管

14、吸光度；As1、AS2、AS3为样品测定管与对照管吸光度的差值FW:样品鲜重（g）；Vt：酶提取液总体积（mL）Vs：测定用酶液量（mio）t:测定时间（min）。参考文献：植物生理学研究技术-孙群等编著2005植物生理学实验指导-高俊凤主编2006丙二醛的测定原理植物器官在逆境条件下或衰老时，往往发生膜脂过氧化作用，丙二醛（MDA）是其产物之一，通常将其作为脂质过氧化指标，用于表示细胞膜脂过氧化程度和植物对逆境条件反应的强弱。在酸性和高温的条件下，丙二醛可与硫代巴比妥酸（TBA）反应生成红棕色的3，5，5一三甲基嗯唑一2,4一二酮，在532nm处有最大吸收波长。但该反应会受到可溶性糖的极大干

15、扰，糖与TBA的反应产物在532nm处也有吸收，但其最大吸收波长在450nm处。植物在经受逆境胁迫时可溶性糖增加，因此测定中需排除可溶性糖的干扰，通常加入低浓度Fe3+（使其终浓度为0.5nmol/L,植物组织中铁的含量一般为100300|!g/g干重），以显著增加TBA与糖的显色反应产物在450nm处的吸收。采用双组分分光光度法可分别求出MDA和可溶性糖的含量。该法针对混合液中的两个组分，它们的光谱吸收峰虽有明显的差异，但吸收曲线彼此又有些重叠，可根据LambertBeer定律，通过代数方法，计算出一种组分由于另一种组分存在时对OD值的影响，最后分别得到两种组分的含量。仪器：实验仪器分光光度

16、计，离心机，研磨器，恒温水浴，具塞试管试剂：三氯乙酸，石英砂，硫代巴比妥酸（TBA）溶液（用10%TCA配制0.6%的TBA溶液，称0.6gTBA，定容100ml）实验方法：1小麦在抽穗期停止浇水，进行干旱处理，取叶片1g将其剪碎，加入10%三氯乙酸（TCA）2mL和少量石英砂，研磨；进一步加入8mLTCA充分研磨，匀浆液以4000g离心10min，上清液即为样品提取液2显色反应及测定吸取2mL提取液，加入2mL0.6%TBA液，混匀，在试管上加盖塞，置于沸水浴中沸煮1015min（不得超过此时间）迅速冷却，离心。取上清液测定532nm和450nm,600nm处的OD值。对照管以2mL水代替提

17、取液。3计算MDA与TBA反应产物的最大吸收峰在532nm,TBA与可溶性糖（以蔗糖为例）的反应产物的最大吸收峰在450nm,吸收曲线彼此又有重叠（下图）。根据LambertBeer定律，最大吸收光谱峰不同的两个组分的混合液，它们的浓度C与OD值A有如下关系：A1=Ca”a1+Cb:.-b1(1)A2=Ca式中：Aj为组分a和组分b在波长神寸OD值之和；A2为组分a和组分b在波长2时OD值之和Ca为组分a的浓度，单位为卩mol/L;Cb为组分b的浓度，单位为卩mol/Lb分别为a、b在1时的摩尔吸收系数;-a2、b2分别为a、b在2时的摩尔吸收系数已知蔗糖与TBA反应产物在450nm和532n

18、m的摩尔吸收系数分别为85.40、7.40;MDA与TBA显色反应产物在450nm波长下无吸收，吸收系数为0于532nm波长下的摩尔吸收系数为155000,根据（1）、（2）可得：1.251.00500600波tC/nm图8-2MDN、廉新及氏糾合物与TBA反应产物的吸收光谱图九MmmolL庫枷注gnimoi/l.荊棘I.站Mrriol/LM）/（.fi4卩m“l/TME）AX85.4月X巴4+55000Xrh求解方程得:cB0,0I171Ali（巾=645X10尺XA訂g一656X10fiXA45式中：Ca为蔗糖与TAB反应的浓度，单位是卩mol/LCb为MDA与TAB反应的浓度，单位是卩m

19、ol/L根据上面公式即可计算样品提取液中MDA的含量，然后再计算每克样品中MDA的含量注意：要求分光光度计的准确MDA浓度=6.45*（A532-A600）-0.56*A450C:MDA浓度（卩mol/L）Vt:样品提取液的总体积（ml）V1:样品提取液和TBA溶液总反应液体积（ml）V2:与TBA反应的样品提取液体积（ml）W:样品鲜重（g）参考文献：赵世杰、许长成等植物组织中丙二醛测定方法的改进植物生理学通讯，1994,30（3）207-210程贵、胡文玉等提取植物中MAD溶剂及MAD作为衰老指标的探讨植物生理学通讯,1991,27（1）:44-46总蛋白含量的测定原理考马斯亮蓝在酸性溶液

20、中呈棕红色，当它与蛋白质结合后则呈现蓝色。在一点范围内，溶液在595nm波长下的吸光值与蛋白质含量成正比，符合比色法测定原理，因此可以用于蛋白质的定量测定。本法试剂配制简单，操作简便快捷，灵敏度比Folin-酚法还高4倍，测定范围1-1000卩g,而且干扰物质少，蛋白质间变动也较小，是一种长用的蛋白质快速微量测定方法。仪器：分光光度计，分析天平，刻度吸管（1mL,5mL），离心机。试剂：1考马斯亮蓝G-250试剂：称取20mg的考马斯亮蓝G-250,溶于10mL95%乙醇中加入20mL85%（W/V）的磷酸，用水定容至200mL。此试剂常温下可保存30天2标准蛋白质溶液：精确称取牛血清蛋白10

21、mg,加水溶解并定容至100mL，即为100卩g/mL的标准蛋白质溶液。实验方法1标准曲线的制作取6支试管，编号，按下表加入试齐叽口管号试剂、123456蛋白质标准溶液/mL00.20.40.60.81.0蒸馏水/mL1.00.80.60.40.20考马斯亮蓝试剂/mL555555蛋白质含量/卩g020406080100混匀，各管震荡程度应该尽量一致。放置10min，在595nm波长下比色测定，比色应在1h内完成。以牛血清蛋白含量（卩g）为横坐标，以吸光值为纵坐标，绘制标准曲线。2样品中蛋白质含量的测定准确称取约0.750g小麦幼苗叶片，放入研钵，加10mL蒸馏水在冰浴中研成匀浆，再在4000

22、r/min离心10min，将上清液倒入10mL容量瓶，再向残渣中加4mL蒸馏水，悬浮，4000r/min离心10min并合并上清液，定容至刻度。另取2根试管，分别准确加入0.1mL样品提取液，0.9mL蒸馏水和5mL考马斯亮蓝G-250试剂,其余操作与标准曲线绘制相同，测其吸光值。计算公式：冲工查得的蛋白质含童（隅）其提取液总体积（mL）样品蛋白质含量（d=,.:参考文献：化学生物学实验弹志主编脯氨酸的测定原理高等植物在逆境条件下脯氨酸含量上升已引起普遍关注，研究脯氨酸在逆境生理中的作用时可用此方法测脯氨酸含量。脯氨酸溶于磺基水杨酸后与茚三酮反应呈红色反应，红色物质可用甲苯液萃取后在520nm

23、处比色，红色深浅与脯氨酸含量有线性关系。仪器：仪器大试管、刻度吸管（2mL、5mL）、容量瓶（50mL）、烧杯、具塞试管、注射器、分光光度计、恒温水浴，天平试剂：1茚三酮试剂：称取1.25g茚三酮溶于30mL冰乙酸与20mL6mol/L磷酸中，70C加热搅拌。冷却后可置冰箱中，4C条件可用2d。1. 2.3%磺基水杨酸溶液3冰乙酸4.100卩g/mL脯氨酸标准液：称取分析纯脯氨酸10.0mg,溶解后定容至100mL甲苯实验方法脯氨酸提取取0.050.5g小麦叶片，用3%磺基水杨酸溶液研磨提取，磺基水杨酸的最终体积为5mL。匀浆液转入玻璃离心管中，在沸水浴中浸提10min。冷却后，以3000r/

24、min,离心10min，取上清液待测。2. 脯氨酸标准曲线的制作及样品的测定取7个25mL容量瓶编号17,分别加入0mL、0.5mL、1.0mL、1.5mL、2.0mL、2.5mL和3.0mL脯氨酸标准溶液水定容到25mL。取8支具塞试管，分别编号1-8号，1-7号取上述容量瓶的脯氨酸液，8号为样品测定管。按下表操作标准曲线的制柞和样品测定的试剂抑入方法管号123456?8脯亂盛标坡液*样我（mL）02222222水(mL)2000000Q冰乙輙（mL）22222222苗三酮222Z2222朋霰腔液度（阿AnU0123436X上述8支管沸水浴30min后冷却至室温，各加4mL甲苯，萃取0.5m

25、in后静置，分层后用注射器吸取上层红色溶液，520nm波长下读A值，制作标准曲线，并查出X值。计算公式：脯氨酸含量（|,洛?）=m式中：X-样品在标准曲线中查出的浓度（卩g/ml）m-样品量（g样品如不是以g为单位，就要换算为以g为单位）注意事项：配制的酸性茚三酮溶液仅在24h内稳定，因此最好用时现配。茚三酮的用量与脯氨酸的含量相关。一般当脯氨酸含量在10卩g/mL以下时，显色液中茚三酮的浓度要达到10mg/mL才能保证脯氨酸充分显色。参考文献生态学实验与实习-杨持主编2008可溶性糖的测定原理糖在浓硫酸作用下，可经脱水反应生成糠醛或羟甲基糠醛，生成的糠醛或羟甲基糠醛可与蒽酮反应生成蓝绿色糠醛

26、衍生物，在一定范围内，颜色的深浅与糖的含量成正比，故可用于糖的定量测定。该法几乎可以测定所有的碳水化合物，不但可以测定戊糖与己糖，而且可以测所有寡糖类和多糖，其中包括淀粉、纤维素等（因为反应液中的浓硫酸可以把多糖水解成单糖而发生反应）。所以用蒽酮法测出的碳水化合物含量，实际上是溶液中全部可溶性碳水化合物总量，在没有必要细致划分各种碳水化合物的情况下，用蒽酮法可以一次测出总量，省去许多麻烦，因此，有特殊的应用价值。但在测定水溶性碳水化合物时，因与葸酮试剂发生反应而增加了测定误差。此外，不同的糖类与蒽酮试剂的显色深度不同，果糖显色最深，葡萄糖次之，半乳糖、甘露糖较浅，五碳糖显色更浅，故测定糖的混合

27、物时，常因不同糖类的比例不同造成误差，但测定单一糖类时，则可避免此种误差。糖类与蒽酮反应生成的有色物质在可见光区的吸收峰为630nm,故在此波长下进行比色。仪器：器具分光光度计、电炉、铝锅、20mL刻度试管、刻度吸管5mL1支、lmL2支、记号笔、适量的吸水纸。试剂：1蒽酮（称取0.2g蒽酮，溶于80%浓硫酸（将98%浓硫酸稀释，把浓硫酸缓缓加入到蒸馏水中）200mL中，冷却至室温，贮于具塞棕色瓶内，冰箱保存，可使用2-3周）。2.98%浓硫酸（相对密度1.84）。3.100/Ig/mL葡萄糖溶液：葡萄糖在80C烘箱烘至恒重，准确称取25mg分析纯无水葡萄糖，溶于蒸馏水定容到25ml实验方法1

28、. 可溶性糖的提取取新鲜植物叶片，擦净表面污物，剪碎混匀，称取0.100.30g,共3份,分别放人3支刻度试管中，加入510mL蒸馏水，塑料薄膜封口，于沸水中提取30min（提取2次），提取液过滤人25mL容量瓶中，反复冲洗试管及残渣，定容至刻度。1标准曲线的制作取20mL刻度试管6支，从05分别编号，按下表加入标葡萄糖溶液，然后按顺序向试管内加人试剂，充分振荡，立即将试管放人沸水浴中，逐管准确保温lmin,取出后自然冷却至室温，以空白作对照，在625nm波长下测其光密度，以光密度为纵坐标，以糖含量为横坐标，绘制标准曲线，并求出标准线性方程。试管编号试剂/mL012345100卩g/mL葡萄糖

29、溶液00.20.40.60.81.0蒸馏水10.80.60.40.20蒽酮试剂555555蔗糖含量/（卩g/管）0204060801003. 显色测定吸取样品提取液0.5mL于20mL刻度试管中（重复两次），加蒸馏水1.5mL，以下步骤与标准曲线测定相同，测定样品的光密度A625。对照曲线求的未知溶液的可溶性糖含量。可溶性糖的含量（）=厂丄-10WV1C:可溶性糖量（卩g/mL）VT：样品提取液总体积（mL）W:样品鲜重（g）V1:显色时取样品用量（g）参考文献2006基础生物学实验教程-王德良，周小慧主编化学生物学实验弹志主编ABA的测定仪器：灭菌锅，低温冰箱，温箱，通风橱，离心机，电子天平

30、，酶标分光光度计，Ci8胶柱，聚苯乙烯微量滴定板，氮气钢瓶，研钵，具塞试管等试剂：1.50mmol/LNaHC03缓冲液，pH9.62.50mmol/LTrisHCl缓冲液（内含150mmol/LNaCI和Immol/LMgCl2），pH7.8，此液为测定缓冲液（TBS）3. 在1LTBS中加lg明胶，高压灭菌（12012）30min4稀释1mg冰冻干燥的兔抗鼠免疫球蛋白（RAMIG）于20mL试剂中5以试剂1溶解冰冻干燥的克隆抗体（mAb），使ABA的mAb浓度为0.2mg/20mL6以试剂3溶解碱性膦酸酯酶（AP）一标记激素液，酶标液的最终稀释倍数为1:500。酸性植物激素（IAA、GA4

31、和ABA）可用碳二亚胺（EDC）法直接将其羧基连接到AP的一NH2上7以试剂1溶解对硝基苯膦酸酯（1mg/mL），该试剂在使用前配制2. 8.重氮甲烷的制备：取3只15mL带盖试管A、B、C,在通风橱内于A管中分别加人1mL40%（WV1）KOH、5mL乙醚和500mg亚硝基甲基脲（CH3NHCONH2SigmaN一0132），在盐冰浴上搅拌10min。待乙醚层呈黄色时，吸取上层含重氮甲烷的乙醚溶液加入试管B,加数粒KOH结晶静置30min，将上清液吸人试管C。C管中的产品可直接使用或于低温（一20C）下可保存1周。亚硝基甲基脲有致癌作用，操作时应注意安全实验方法1植物样品中激素的提取准确称取

32、100mg鲜重的植物样品，置于预冷（0C）的研钵中，加入1mL80%的甲醇（内含10mg/L的丁羟甲苯BHT）研磨或匀浆，静置片刻后将上清液吸入离心管，残渣再加1mL甲醇研磨一次，然后一并倒入离心管，加1mL甲醇液洗涤研钵后倒入离心管，离心（离心力为5000g,10min,4C），取出上清液于20C保存或用于亲酯色素的分离。以上操作过程应在弱光下进行用C18胶柱去除亲酯色素C18胶柱（SepPakC18Cartridge,Water公司产品）可根据样品溶质极性的不同，分离水溶液或极性较大的水和有机溶剂的混合物。当C18胶柱用于含水样品时，应先用2mL可与水混合的溶剂如甲醇、乙腈等平衡，然后用与

33、样品浓度相等的溶剂湿润胶柱，洗脱样品，最后可用非极性的溶剂去除残留在胶柱上的污染物。具体过程如下： 以5mL甲醇平衡C18胶柱，然后去除甲醇 以5mL70%甲醇漂洗C18胶柱，去除漂洗液 加样（一般一次不超过5mL80%甲醇粗制液） 将5mL甲醇通过C18胶柱，再用5mL乙醚通过胶柱洗去亲酯色素，以便胶柱的重新用反复步骤，根据对样品纯度要求，一般C18胶柱可反复使用10次左右3植物样品的甲酯化取适量（100L左右）经过C18胶柱的植物样品，于试管内氮气吹干，后加100止乙酸乙酯或甲醇重新溶解，再加入过量（100200肚）的重氮甲烷直至样液呈浅黄色，于冰浴反应10min，然后用100”L0.2m

34、ol/L乙酸的甲醇液破坏过量的重氮，甲烷（至黄色消失为止）。以氮气吹干样液，加少量甲醇（最终浓度不超过10%）和测定缓冲液（TBS）,溶解后即可用于测定。 4样品的测定将RAMIG（试剂）加入到聚苯乙烯微量滴定板（96孔微孔板）微孔中，置于410C过夜， 然后倒弃溶液，用自来水漂洗一次加0.2mL稀释的mAb（试剂），于410C反应24h倒弃清液，用自来水漂洗2次于各孔加入0.05mLTBS,0.1mL不同浓度的标准激素液或植物样品液。在黑暗处于410C 反应1h加0.05mL稀释酶标液，混匀，于410C反应3h倒弃清液，用自来水漂洗2次加0.2mL对一硝基苯膦酸酯（试剂），于37C保温1h以

35、0.05mL5mol/LKOH终止反应。用酶标分光光度计在410nm处测定各孔的光密度。某种植物激素浓度与测定光密度间关系B/Bq经线性化，即求激素浓度的对数值（其中Bo为不加激素时的结合率，B为样品液的结合率）。其反对数值，即为样品中激素的含量。用于EL1SA测定的内源植物澈素提取稈序可总结如下：预冷的植物材料研碎提取mL80%甲职含10mgL1BHT）稀释样品渡最终70%甲醉+过鼻胶拄以氮弋吹干i加TBS溶解I直接用于N定ABA参考文献生态学实验与实习-杨持主编2008矿质元素（Na、K、Cl）的测定Na、K的测定原理以火焰为激发光源的原子发射光谱法叫火焰光度法。它将待测试样溶液用喷雾的方

36、法，以气溶胶形式引入火焰中，用火焰的热能将待测试样元素原子化并激发出它的特征光谱。然后，利用光电检测系统测量待测元素特征光谱的强度，当实验条件（包括燃料气体和压缩空气的供应速度，样品溶液的流速，溶液中其他物质的含量等）保持一定时，则发射光谱的强度I与待测元素的浓度c之间成正比I=ac（a为一稳定的常数）通过测量待测元素特征波长谱线的强度，进行定量分析。在火焰激发下，K原子发射766.8nm的谱线，Na原子发射589.0nm的谱线，分别测量这两种谱线的相对强度，禾U用标准曲线进行K、Na的定量测定。本实验使用液化石油气空气火焰，测定植物样品中K、Na的含量。先将样品用湿消化法处理成分析试液，然后

37、用标准曲线法进行定量分析。仪器：仪器6400型火焰光度计、可调温电热板电子天平或分析天平、吸量管（5mL,10mL）、锥形瓶（100mL）、容量瓶（50mL）、曲颈小漏斗烧杯（250mL）、洗瓶、移液管（25mL）试剂：1. K贮备标准溶液(0.1000g/L)(称取0.1907g于400450C灼烧到恒重溶于出0后移入1000ml容量瓶中，加H20稀释定容，转入聚乙烯试剂瓶中保存。)2. Na贮备标准溶液(0.1000g/L)(称取0.2542g经烘干2h的NaCl，溶于出0后，移入1000mL容量瓶中，加H2O稀释定容，转入聚乙烯试剂瓶中保存。)3. Na、K混合标准工作溶液(移取25.0

38、0mLK贮备标准液，12.50mLNa贮备标准液于50mL容量瓶中，加出0稀释定容。)4. 三酸混合溶液(HN03(d=1.42),H2S04(d=1.84),HCl04(60%)以8:1:1的比例混合5.41HCl溶液(1%)实验方法1样品的预处理称取1.0g(准确至O.lmg)通过35号筛的干样品，置于100ml锥形瓶中，加10.0ml三酸混合液。在通风橱中于电此过程23min即可完成，见到H2SO4入23粒沸石以防暴沸，瓶口加一曲颈小漏斗，移人热板上低温消化40min后，升温使HCIO4冒白烟分解,回流，即呈现缕状的白烟时取下锥形瓶，稍冷后，加20mL左右1%HCl，加热至沸以溶解残渣，

39、趁热用快速滤纸过滤至50ml容量瓶中，用热的1%HCl洗涤沉淀3次，洗至滤液近刻度后加水定容，摇匀。2标准溶液的配制在5个50mL容量瓶中，分别加入1.00mL,2.00mL,3.00mL,4.00mL,5.00mLK、Na混合标准工作溶液，加H2O稀释定容，摇匀。3. K、Na含量的测定开动仪器并点火，选择适当的灵敏度并用蒸馏水喷雾调零，用标准曲线中浓度最大的溶液调节仪器满刻度。仪器预热1020min后，由稀到浓依次测定标准系列溶液和未知试样溶液的发射强度，每个溶液要测定3次，取平均值以浓度为横坐标，以K、Na的发射强度为纵坐标，分别绘制K、Na的标准曲线。由未知试样的发射强度求出植物样品中

40、的K、Na的含量(以质量分数.表示)参考文献实验化学-李清禄，何海斌主编2006Cl的测定原理用稀硝酸分解干样，加入乙醇，使其体积分数为75%。在pH值为3.5左右，以二苯偶氮碳酰肼为指示剂，用硝酸汞标准滴定溶液进行滴定。试剂：1. 氢氧化钠溶液(0.5moL/L):将2g氢氧化钠溶于100mL水中2. 硝酸溶液(0.5mol/L):取3mL硝酸(质量分数65%)，用水稀释至100mL。3. 溴酚蓝指示剂溶液(1g/L):将0.19溴酚蓝溶予100mL乙醇(1+4)中。4. 二苯偶氮碳酰肼指示剂溶液(10g/L):将1g二苯偶氮碳酰肼溶于100mL乙醇中。5. 氯标准溶液：准确称取0.3297

41、9已在105C110C烘过2h的光谱纯或基准氯化钠，溶于少量水中，然后移人1L容量瓶中，用水稀释至标线，摇匀。1mL此溶液含0.2mg氯。吸取200mL上述溶液，注入1L容量瓶中，用水稀释至标线，摇匀。1mL此溶液含0.04mg氯。5. 硝酸汞标准滴定溶液C(Hg(NO3)2)=0.005mol/L:称取1.719硝酸汞Hg(NO3)2出0，溶于10mL硝酸溶液(0.5mol/L)中，移人1L容量瓶内，用水稀释至标线，摇匀。实验方法1.硝酸汞标准滴定溶液的标定用微量滴定管准确加入0.20mg(或1.40mg)氯标准溶液于50mL锥形瓶中，加入20mL乙醇(体积分数95%卜2滴溴酚蓝指示剂溶液(

42、1g/L)及数滴氢氧化钠溶液(0.5moL/L)至溶液呈蓝色，然后滴入硝酸溶液(0.5mol/L)至溶液刚好变黄，再过量1滴(pH值约为3.5),加入10滴二苯偶氮碳酰肼指示剂溶液(10g/L),用硝酸汞标准滴定溶液C(Hg(NO3)2)=0.001mol/L或硝酸汞标准滴定溶液C(Hg(NO3)2)=0.005mol/L滴定至樱桃红色出现。同时进行空白试验。硝酸汞标准滴定溶液对氯的滴定度Tci，按下式计算：0.Q2140Tci=或Tci=V-VQV-VQ式中：V标定时消耗硝酸汞标准滴定溶液的体积，mLV0-空白试验消耗硝酸汞标准滴定溶液的体积，mL2称取约0.1g样品，精确至0.0001g,

43、放入200mL烧杯中，加入10mL水，5mL硝酸溶液(0.5mol/L)，加热煮沸，保持微沸1min2min，取下，冷却至50C以下，加入25mL乙醇，搅拌均匀，加入1滴溴酚蓝指示剂溶液(1g/L)及数滴氢氧化钠溶液(0.5mol/L)至溶液呈蓝色，然后滴人硝酸溶液(0.5mol/L)中和至溶液刚好变为黄色，再过量1滴，加入10滴15滴二苯偶氮碳酰肼指标剂溶液(10g/L)，用硝酸汞标准滴定溶液C(Hg(NO3)2)=0.001mol/L或硝酸汞标准滴定溶液C(Hg(NO3)2)=0.005mol/L滴定至亮紫色出现。进行试样分析时，应同时进行空白试验，并对所测结果加以校正。示试样中氯的质量分数扯(C1)按下式计算：U*先I(V-%)(C1)=一；式中：To-硝酸汞标准滴定溶液对氯的滴定度，mg/mLV0-空白试验消耗硝酸汞标准滴定溶液的体积，mLV-滴定时消耗硝酸汞标准滴定溶液的体积，Ml参考文献水泥及其原材料化验方法与设备-刘文长，崔健，杨鑫编著2009