DNA重组克隆的单元操作课件

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1、第 2 章DNA重组克隆的单元操作 DNA重组的载体； DNA的体外重组； 重组DNA分子的转化与扩增； 转化子的筛选与重组子的鉴定； 目的基因的克隆。2.1 用于基因克隆的载体质粒（plasmid）噬菌体考斯质粒（cosmid）与噬菌粒人造染色体载体载体的功能及特征载体的功能及特征1.载体的功能 为外源基因提供进入受体细胞的转移能力 为外源基因提供复制能力或整合能力 为外源基因的扩增或表达提供必要的条件2.载体应具备的条件 具有针对受体细胞的亲缘性或亲和性。 具有多种单一的核酸内切酶识别切割位点。 具有合适的筛选标记。 具有与特定受体细胞相适应的复制位点或整合位点。 质粒1.质粒的基本特征

2、质粒是生物细胞内固有的、能独立于寄主染色体而自主复制、并被稳定遗传的一类核酸分子。质粒常见于原核细菌和真菌中。绝大多数的质粒是DNA型的。绝大多数的天然DNA质粒具有共价、封闭、环状的分子结构。 质粒DNA的分子量范围：1 - 100 kb。质粒的自主复制性：拷贝数的控制机制 质粒DNA复制启动控制控制复制引物与模板的结合oriE.coli ColE1 plasmid复制方向rop（+）RopRNA IIRNA I3553质粒质粒的基本特征质粒的自主复制性：拷贝数的控制机制 质粒DNA复制启动控制控制复制起始因子与复制起始位点（ori）的结合PcopcopP/OrepreporiCopRep

3、可扩增性根据在每个细胞中的分子数（拷贝数）多寡，质粒可分为两大复制类型：严紧型复制控制的质粒 1 - 5 拷贝 stringent plasmid松弛型复制控制的质粒 30 - 50 拷贝 Relaxed plasmid 质粒的可转移性革兰氏阴性菌的质粒可分成两大类： 接合型质粒： 能在天然条件下自发地从一个细胞转移到另一个细胞（接合作用）。 非接合型质粒：不能在天然条件下独立地发生接合作用。 质粒的不相容性 任何两种含有相似复制子结构的不同质粒，不能同时存在于一个细胞中，这种现象称为质粒的不相容性。以大肠杆菌的质粒为例：ColE1、pMB1 拥有相似的复制子结构，彼此不相容pSC101、F拥

4、有相似的复制子结构，彼此不相容 携带特殊的遗传标记物质抗性：抗生素、重金属离子、紫外线、X射线物质合成：细菌毒素、有机碱这些标记基因对DNA重组分子的筛选具有重要意义。2.质粒的改造与构建 野生型质粒分子量大、拷贝数低、单一酶切位点少、遗传标记不理想。目前实验室使用的大肠杆菌质粒大多由pSC101、ColE1和pSF2124构建。 删除非必需区域DNA。 灭活某些质粒的编码基因。如mob基因，负调控基因 加入标记基因。 添加MCS，删除重复酶切位点。 加上一些调控序列。3.质粒的分类人工构建的质粒根据其功能和用途可分成如下几类： 高拷贝质粒 扩增基因低拷贝质粒 表达某些毒性基因测序质粒 用于测

5、序整合质粒 外源基因的整合穿梭质粒 基因克隆表达质粒 表达外源基因探针质粒 启动子等元件的克隆筛选4.重要的大肠杆菌质粒载体松弛型复制 pBR3224363 bpOrigin of ReplicationROPROISal IBamH ITcrPvu IPst IPst IEcoR ICla IHind IIIHind IIBal IApr pBR322： 氯霉素可扩增拷贝数 50 - 100 / cell用于基因克隆 pUC18 / 19： 拷贝数 2000 - 3000 / cell用于基因克隆和测序 装有多克隆位点（MCS）正选择颜色标记 lacZBamHIpUC182686 bpApr

6、lacZoriGAATTCGAGCTCGGTACCCGGGGATCCTCTAGAGTCGACCTGCAGGCATGCAAGCTT396452EcoRISstIKpnISmaIXbaISalIPstISphIHindIIIpUC18 / 19：正选择标记 lacZ 的显色原理pUC18/19PlaclacZMCSb-半乳糖苷酶的a-肽段OHHHOHHOHHOHCH2OHONClBrClBrClBrONN5-溴-4-氯-3-吲哚基-b-D-半乳糖苷X-gal蓝色 pGEM-3Z：多拷贝装有两个噬菌体的强启动子装有多克隆位点（MCS）正选择颜色标记 lacZ用于外源基因的高效表达 注意：T7和SP6

7、启动子特异性地由噬菌体DNA编码的RNA聚合2743 bpMCSlacZPT7oriAprpGEM-3ZPSP6酶所识别，因此相应的受体菌必须表达噬菌体RNA聚合酶。如E.coli BL21（DE3）等。碱溶法 i.用含有EDTA的缓冲液悬浮菌体 ii.加溶菌酶裂解细菌细胞壁 iii.加NaOH和SDS的混合溶液，去膜释放内含物 iv.加高浓度的醋酸钾溶液，沉淀染色体，去除染色体DNA及大部分蛋白质 v.离心取上清液，用苯酚-氯仿萃取，去除痕量的蛋白质vi.乙醇或异丙醇沉淀水相质粒DNAvii.用无DNase的RNase去除残余的RNA cccDNAL-DNAocDNA5.质粒DNA的分离纯化

8、 沸水浴法 i.用含有EDTA和Triton X-100的缓冲液悬浮菌体 ii.加溶菌酶裂解细菌细胞壁 iii.沸水浴40秒钟iv.离心，用无菌牙签挑去沉淀物 v.乙醇或异丙醇沉淀质粒DNA噬菌体 噬菌体是一类特异性的病毒，能高效率高特异性地侵染宿主细胞，然后或自主复制繁殖，或整合入宿主基因组中潜伏起来，而且在一定的条件下上述两种状态还会相互转化。1. 大肠杆菌的 l 噬菌体DNA l 噬菌体的生物学特性l 噬菌体是大肠杆菌的温和型噬菌体l 噬菌体由外壳包装蛋白和l-DNA组成 l-DNA全长48.5kb全基因组共36个基因 生物结构5 GGGCGGCGACCT33CCCGCCGCTGGA 5

9、 COSCOScos头部合成基因尾部合成基因溶菌控制基因晚期控制基因DNA合成控制基因阻遏基因早期控制基因阻遏基因重组基因删除与整合基因l l - DNA 感染裂解周期E.coli吸附LamB受体注入复制包装裂解体内包装100个左右的拷贝包装范围为原DNA的75 - 105%即 36 - 51 kbDA 溶原状态 l噬菌体感染大肠杆菌后，除能裂解细胞外，也可能将其DNA直接整合到宿主细胞的染色体DNA上，并不产生子代噬菌体颗粒，这种情况为溶原状态。 DNA重组技术一般需要l噬菌体进入溶菌状态。 l-DNA载体的构建 野生型l-DNA包装的上限为51kb，本身长度为48.5kb，只有当插入的外源

10、DNA片段不大于2.5kb时，才能被包装成有感染力的噬菌体颗粒。 根据切除的多少，可将l-DNA分成两大类载体： 插入型载体取代型载体 缩短长度插入型载体体外包装插入位点体外包装插入片段载体长度 37 kb插入片段大小：0 - 14 kb（51 37）取代型载体体外包装体外包装插入片段最小装载长度 10 kb（51 26）载体长度 26 kb插入片段最大装载长度 25 kb（36 26） 删除重复的酶切位点野生型的l-DNA链上有5个EcoRI位点和7个HindIII位点，不利于重组操作，必须删除至1 - 2个。同时，为了便于各种来源的DNA片段的克隆，还需要增加一些单一的酶切位点。灭活某些与

11、裂解周期有关的基因，构建琥珀密码子的突变体 琥珀型突变（sup)是指由CAG（Gln）向UAG（stop）的突变。大肠杆菌的某些菌株含有特异性的校正基因，其编码产物校正tRNA能专一性地纠正这一突变。 基因工程实验中使用的受体则是具有琥珀型突变体校正功能的菌株。 加装选择标记野生型l-DNA上缺少合适的选择标记。l-DNA克隆载体上的选择标记主要有下列两类：免疫功能类标记颜色反应类标记加装选择标记：cl+含有完整标记基因的l-载体进入受体细胞后，建立溶原状态，细菌生长缓慢，形成浑浊斑；当外源DNA插入到标记基因中，基因灭活， l-重组分子便进入溶菌循环，形成透明斑。加装选择标记：lacZlac

12、Z基因编码b-半乳糖苷酶，能催化无色的X-gal生成蓝色化合物。当外源基因插入到lacZ基因中，基因灭活，不能合成蓝色化合物；而空载体l-DNA则产生蓝色透明斑。以以EcoR为例为例A、B、C、D、E和和F片段长度分别为片段长度分别为21.6kb、4.9kb、5.5kb、7.5kb、5.9kb和和3.3kb用于建立用于建立cDNA文库和克隆外源目的基因文库和克隆外源目的基因2.6kb非必需区引入筛选标记非必需区引入筛选标记 l-DNA重组分子的体外包装 l-DNA重组分子需在体外人工包装成有感染力的噬菌体重组颗粒，方可高效导入受体细胞。 用于体外包装的蛋白质可直接从感染了l噬菌体的大肠杆菌中提

13、取，现已商品化。 l-DNA及其重组分子的分离纯化 将大肠杆菌在含有麦芽糖的培养基中培养至对数生长期； 加入l噬菌体或重组l噬菌体的悬浮液，37培养1小时； 用新鲜培养基稀释，继续培养4 -12小时。这时噬菌体颗粒 密度已达1013 -1014 / L，大肠杆菌细胞已完全裂解； 超速离心，沉淀噬菌体； 苯酚抽提，释放l-DNA ； 乙醇或异丙醇沉淀l-DNA 。 l-DNA作为载体的优点 l-DNA可在体外包装成噬菌体颗粒。 l-DNA载体的装载能力为25 kb，远远大于质粒的装载量。 重组l-DNA分子的筛选较为方便。 重组l-DNA分子的提取较为简便。 2.大肠杆菌的M13单链噬菌体DNA

14、 M13噬菌体的生物学特性M13噬菌体的外型呈丝状M13 噬菌体由外壳包装蛋白和正链DNA组成 M13 DNA全长6407个核苷酸M13 DNA上有10个基因2700个外壳蛋白分子M13 噬菌体不裂解宿主细胞，但抑制其生长 生物结构 感染周期E.coli基因基因II蛋白蛋白基因基因II蛋白蛋白基因基因V蛋白蛋白+ DNA+ DNA+ DNA M13 DNA载体的构建III VI I IV II X V VII IX VIII野生型M13RF-DNAIII VI I IV II X V VII IX VIIIM13mp系列载体lacZpolylinker 通过定点诱变技术封闭重复的重要限制性酶切

15、口； 引入合适的选择性标记基因；引入合适的选择性标记基因； 在MCS接头片段的两侧区域改为统一的DNA测序引物。 加入MCS；考斯质粒与噬菌粒 考斯质粒和噬菌粒载体的构建是为了提高噬菌体DNA的装载量。 将噬菌体DNA中与包装有关的序列与质粒组装在一起，既能最大限度地缩短载体的长度，同时又能保证重组DNA分子在体外仍被包装成有感染力的颗粒，这便是构建考斯质粒和噬菌粒载体的思路。1.考斯质粒（cosmid） 考斯质粒载体的构建考斯质粒是一类人工构建的含有pHC796100 bpTcrl fragmentcosoriAprPstIBamHISalIl-DNA cos序列和质粒复制子的特殊类型的载体

16、。1.7 kb的l-DNA片段 + pBR322片段装载范围为31 - 45 kb。 考斯质粒载体的特点 能像l-DNA那样进行体外包装，并高效转染受体细胞。 装载量大（45 kb）且克隆片段具有一定的大小范围。 能像质粒那样在受体细胞中自主复制。 重组操作简便，筛选容易。 不能体内包装，不裂解受体细胞。pUC118 pUC18 + M13间隔区 IGpUC119 pUC19 + M13间隔区 IG500 个拷贝3200 bpMCSlacZlacIoriAprM13-IGpUC118 / 119表示M13辅助噬菌体DNA2.噬菌粒（phagemid or phasmid） 噬菌粒载体的构建 噬

17、菌粒是一类人工构建的含有丝状噬菌体间隔区（IG）以及质粒复制子、克隆位点、标记基因的特殊类型的载体。 噬菌粒载体的特点 具有质粒的基本性质，便于外源DNA片段的克隆及重组子的筛选; M13-DNA的重组分子在复制时常会发生DNA缺失，而噬菌粒重组分子则相对稳定； 在一定程度上提高了外源DNA片段的装载量； 通过克隆双链DNA能获得同等长度的单一单链DNA。人造染色体载体 将细菌接合因子或酵母菌染色体上的复制区、分配区、稳定区与质粒组装在一起，即可构成染色体载体。当大片段的外源DNA克隆在这些染色体载体上后，便形成重组人造染色体，它能像天然染色体那样，在受体细胞中稳定的复制并遗传。 目前常用的人

18、造染色体载体包括：细菌人造染色体（BAC）酵母人造染色体（YAC）1.细菌人造染色体(Bacterial Artificial Chromosomes BAC)细菌人造染色体通常是在大肠杆菌性因子F质粒的基础上构建的，其装载量范围在50 - 300 kb之间。pBACs主要适用于：克隆大型基因簇（gene cluster）结构构建动植物基因文库2.酵母人造染色体(Yeast Artificial Chromosomes YAC)YAC载体应含有下列元件： 酵母染色体的端粒序列 酵母人造染色体的构建pYAC4CEN4EcoRIURA3TELBamHITELoriAprTRP1ARS1酵母染色体的

19、复制子 酵母染色体的着丝粒序列 酵母系统的选择标记大肠杆菌的复制子 大肠杆菌的选择标记YAC载体的装载量为350 - 400 kb 酵母人造染色体的使用pYAC4CENEcoRIURATELBamHITELoriAprTRPARSEcoRIEcoRIEcoRIBamHI连接转化酵母菌重组酵母染色体2.2 DNA的体外重组限制性核酸内切酶DNA连接酶其他用于DNA重组的工具酶DNA切接反应的影响因素DNA分子重组的方法限制性核酸内切酶1. 限制性核酸内切酶的发现及其生物功能 识别双链DNA分子中的特定序列，并切割DNA双链 主要存在于原核细菌中，帮助细菌限制外来DNA的入侵细菌的限制与修饰作用h

20、sd R：编码限制性核酸内切酶hsd M：编码限制性甲基化酶hsd S：编码限制性酶和甲基化酶的协同表达 1968年，Smith等人首先从流感嗜血杆菌d株中分离出 Hind III 2. 限制性核酸内切酶的类型主要特性 I 型 II 型 III 型限制修饰多功能单功能双功能蛋白结构异源三聚体同源二聚体异源二聚体辅助因子ATP Mg2+ SAMATP Mg2+ SAMMg2+识别序列TGAN8TGCT旋转对称序列GAGCCAACN6GTGCCAGCAG切割位点距识别序列1kb处识别序列内或附近 距识别序列下游随机性切割特异性切割24-26bp处限制性核酸内切酶的命名属名 种名 株名H i n d

21、 IIIHaemophilus influenzae d 嗜血流感杆菌d株同一菌株中所含的多个不同的限制性核酸内切酶3. II 型限制性核酸内切酶的基本特性 识别双链DNA分子中4 - 8对碱基的特定序列 大部分酶的切割位点在识别序列内部或两侧 识别切割序列呈典型的旋转对称型回文结构5 G C T G A A T T C G A G 33 C G A C T T A A G C T C 5EcoR I的识别序列EcoR I的切割位点II 型限制性核酸内切酶的识别序列nII 型限制性核酸内切酶的切割方式 同位酶：识别序列相同，切点不同；同位酶：识别序列相同，切点不同； 同裂酶：识别位点与切割位点

22、相同，来源不同；同裂酶：识别位点与切割位点相同，来源不同； 同尾酶：识别位点不同，但切出的同尾酶：识别位点不同，但切出的DNA片段具有相片段具有相同的末端；同的末端； 少数酶切割活性依赖于识别序列内部碱基的甲基化作少数酶切割活性依赖于识别序列内部碱基的甲基化作用。用。EcoRI等产生的5粘性末端5 G-C-T-G-A-A-T-T-C-G-A-G 33 C-G-A-C-T-T-A-A-G-C-T-C 5EcoRI 37 5 G-C-T-G-OH P-A-A-T-T-C-G-A-G 33 C-G-A-C-T-T-A-A-P OH-G-C-T-C 5 退火 4-7 5 G-C-T-G A-A-T-T

23、-C-G-A-G 33 C-G-A-C-T-T-A-A G-C-T-C 5OH POHPII 型限制性核酸内切酶的切割方式PstI等产生的3粘性末端5 G-C-T-C-T-G-C-A-G-G-A-G 33 C-G-A-G-A-C-G-T-C-C-T-C 5PstI 37 5 G-C-T-C-T-G-C-A-OH P-G-G-A-G 33 C-G-A-G-P OH-A-C-G-T-C-C-T-C 5 退火 4-7 5 G-C-T-C-T-G-C-A G-G-A-G 33 C-G-A-G A-C-G-T-C-C-T-C 5OH POHPPvuII等产生的平头末端5 G-C-T-C-A-G-C-T-

24、G-G-A-G 33 C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C 5PvuII 37 5 G-C-T-C-A-G-OH P-C-T-G-G-A-G 33 C-G-A-G-T-C-P OH-G-A-C-C-T-C 5 4. 甲基化酶的基本特性 甲基化酶识别位点与限制性内切酶相同，命名方法在内甲基化酶识别位点与限制性内切酶相同，命名方法在内切酶前加切酶前加M. 一种甲基化酶在封闭一个内切酶切口的同时，可能会产一种甲基化酶在封闭一个内切酶切口的同时，可能会产生另一种酶的切口；生另一种酶的切口； 大肠杆菌的甲基化酶有两种，大肠杆菌的甲基化酶有两种，Dam和和Dcm； 特殊情况。例：特殊情况。例：C

25、la 5-ATCGAT-3DNA连接酶1. T4-DNA连接酶的基本性质 修复双链DNA上缺刻处的磷酸二酯键T4-DNA连接酶5 G-C-T-C-T-G-C-A G-G-A-G 33 C-G-A-G A-C-G-T-C-C-T-C 5OH POHP5 G-C-T-C-T-G-C-A-G-G-A-G 33 C-G-A-G-A-C-G-T-C-C-T-C 5nicknick 修复与RNA链结合的DNA链上缺刻处的磷酸二酯键3 C-G-A-G A-C-G-G-C-C-T-C 5PT4-DNA连接酶5 G-C-U-C-U-G-C-C-G-G-A-G 3OHnick5 G-C-U-C-U-G-C-C-G

26、-G-A-G 33 C-G-A-G-A-C-G-G-C-C-T-C 5 连接多个平头双链DNA分子5 G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G 33 C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C 55 G-C-T-C-A-G-OH P-C-T-G-G-A-G 33 C-G-A-G-T-C-P OH-G-A-C-C-T-C 5 T4-DNA连接酶其他用于DNA重组的工具酶1. 大肠杆菌DNA聚合酶 I（ DNA pol I ） 53 53的DNA聚合酶活性 大肠杆菌DNA聚合酶 I的基本性质：3 G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-A 55 C-G-A-G-T-OH5 ppp

27、 dN Mg2+3 G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-A 55 C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-OHDNA pol I5 A G C T T C A G G A T A 3 | | | | | | | | | | |3 T C G A A G T C C T A G 5 5353的核酸外切酶活性 3535的核酸外切酶活性C切口前移标记DNA 大肠杆菌DNA聚合酶 I 的基本用途：2. 大肠杆菌DNA聚合酶 I 大片段（ Klenow ） Klenow酶的基本性质：5353的DNA聚合酶活性3535的核酸外切酶活性无5353的核酸外切酶活性 补平由核酸内切酶产生的5粘性末端

28、5 G-C-T-G-OH P-A-A-T-T-C-G-A-G 33 C-G-A-C-T-T-A-A-P OH-G-C-T-C 5 KlenowdATP dTTP5 G-C-T-G-A-A-T-T-OH P-A-A-T-T-C-G-A-G 33 C-G-A-C-T-T-A-A-P OH-T-T-A-A-G-C-T-C 5 Klenow酶的基本用途： DNA片段3末端的同位素标记5 G-C-T-G-OH P-A-A-T-T-C-G-A-G 33 C-G-A-C-T-T-A-A-P OH-G-C-T-C 5 Klenowa-32P-pppdA dTTP5 G-C-T-G-A-A-T-T-OH P-A

29、-A-T-T-C-G-A-G 33 C-G-A-C-T-T-A-A-P OH-T-T-A-A-G-C-T-C 5 cDNA第二链的合成 双脱氧末端终止法测定DNA序列2.末端脱氧核苷酰转移酶（TdT）不需要模板的DNA聚合酶，随机掺入dNTPs5 p3 HOOH 3 p 5 TdTMg2+ dATP5 p3 HOAAAAAAAAAAAA OH 3 p 5 5 p3 HOOH 3 p 5 TdTCo2+ dATP5 p3 HO AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA OH 3 p 5 5 p3 HOOH 3 p 5 TdTCo2+ dATP5 p3 HOAAAAAAAAAAAAAA OH 3

30、 p 5 AAAAAAAAAAA5 G-C-T-C-A-G-C-T-C-T-T-G-A-G-G-A-G-T 3S1Zn2+5 G-C-T-C-A-G-C-T-C T-T-G-A-G-G-A-G-T 35 G-C-T-C A-G-C-T-C T-T-G-A-G G-A-G-T 35 dNMPs 或 5 NMPs 内切单链DNA或RNA3. S1核酸酶 内切带缺口或缺刻的双链DNA或RNA5 G-C-T-C-A-G C-T-G-G-A-G-T 33 C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C-A 5 5 G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-T 33 C-G-A-G-T-C A-C-

31、C-T-C-A 5 nickgapS1Zn2+5 G-C-T-C-A-G3 C-G-A-G-T-CT-G-G-A-G-T 3A-C-C-T-C-A 5 特征： 降解单链降解单链DNA或或RNA，包括不能形成双链的区域，降解，包括不能形成双链的区域，降解DNA的速度大于降解的速度大于降解RNA的速度；的速度； 降解反应的方式为内切或外切；降解反应的方式为内切或外切； 酶量过大时会伴有双链核酸的降解；酶量过大时会伴有双链核酸的降解； S1核酸酶常用来切平突出的单链末端及制作核酸酶常用来切平突出的单链末端及制作S1图谱。图谱。4. 单链内切双链外切的核酸酶：Bal31核酸酶Ca2+5 dNMPs 或

32、 5 NMPsssDNA or RNACa2+双链3端外切活性，伴有单链内切活性Bal31Bal31Ca2+Bal31+可控性地截短可控性地截短DNA分子分子5.T4-多核苷酸磷酸激酶（T4-PNP） 催化ATP的g-磷酸基团转移至DNA或RNA的5 末端5 HO3 HOOH 3 OH 5 T4-PNPMg2+ pppATP（g-32P-ATP）5 p3 HOOH 3 p 5 核酸杂交探针分子的同位素标记核酸杂交探针分子的同位素标记 磷酸激酶的交换反应磷酸激酶的交换反应6.碱性磷酸单酯酶来自小牛胸腺的碱性磷酸单酯酶（CIP）来自大肠杆菌的碱性磷酸单酯酶（BAP）5 pOH 3 DNA or R

33、NA5 ppp dN5 pppNBAP / CIPOH 3 5 HO5 HO dN5 HO N催化DNA、RNA 5 端除磷反应去除载体或外源片段去除载体或外源片段5端的磷酸基团端的磷酸基团7. T4-DNA聚合酶 T4-DNA酶的基本特性：在无dNTP时，可以从任何3-OH端外切在四种dNTP均存在时，聚合活性占主导地位5353的DNA聚合酶活性和3535的核酸外切酶活性 外切酶活性外切酶活性 聚合酶活性聚合酶活性 无无dNTP dNTP5335 T4-DNA聚合酶的基本用途：5 G-C-T-C-T-G-C-A-OH P-G-G-A-G 33 C-G-A-G-P HO-A-C-G-T-C-C

34、-T-C 5 T4-DNA聚合酶5 G-C-T-C- OH P-G-G-A-G 33 C-G-A-G-P HO -C-C-T-C 5 切平由核酸内切酶产生的3粘性末端 DNA片段3末端的同位素标记5 G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-T 33 C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C-A 5 Mg2+ 5 ppp dN 5 ppp dA（a-32P-dATP） 5 G-C-T-C-A-G-C-T-G-OH HO-T-C-G-A-C-C-T-C-A 5 T4-DNA polT4-DNA pol5 G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-T 33 C-G-A-G-T-C

35、-G-A-C-C-T-C-A 5 1. II 型限制性核酸内切酶酶解反应的操作 大部分II 型核酸内切酶需要相似的反应条件：Tris-HCl50 mM pH 7.5MgCl210 mMNaCl50 - 150 mMDTT1 mM50 mM 低盐酶100 mM 中盐酶150 mM 高盐酶Volume20 - 100 mlT T37 1 - 1.5 hr1 U 核酸内切酶的酶活性：在最佳反应条件下反应 1 小时，完全水解 1 mg pBR322 DNA所需的酶量。DNA切接反应的影响因素 II 型核酸内切酶的多酶联合酶解： 对盐浓度要求相同的酶，原则上可以同时酶切，但应注意：5 GCTACATGG

36、ATCCCGGGTTCGCAT33 CGATGTACCTAGGGCCCAAGCGTA5BamHI SmaI5 GCTACATG GATCCCGGGTTCGCAT3 3 CGATGTACCTAG GGCCCAAGCGTA55 GCTACATGGATCCC GGGTTCGCAT33 CGATGTACCTAGGG CCCAAGCGTA5对盐浓度要求不同的酶，可采取下列方法： 使用较贵的酶的盐浓度，加大便宜酶的用量，同时酶解。 低盐酶先切，然后补加盐，高盐酶再切； 一种酶先切，然后更换缓冲液，另一种酶再切i. 0.1倍体积的 5 M NaAc pH 5.4ii. 2倍体积的冰冷乙醇iii. 冰浴 5

37、分钟、高速冷冻离心10分钟、干燥 限制性核酸内切酶的星号活性 高浓度的甘油、低离子强度、极端pH值等，会使一些核酸内切酶的识别和切割序列发生低特异性，即所谓的Star activity现象。 EcoR BamH2. DNA连接酶的反应条件Tris-HCl50 - 100 mM pH 7.5MgCl210 mMATP0.5 - 1 mMDTT5 mMVolume10 - 20 mlT T4 - 15 4 - 16 hr1 U DNA连接酶的酶活性：在最佳反应条件下15 反应 1 小时，完全连接 1 mg l-DNA（Hind III片段）所需的酶量。连接温度与时间常用下列组合：连接温度与时间常用

38、下列组合：15 -2h; 12 -8h；7 过夜。过夜。重组率及其影响因素1.重组率的定义重组率 = 含有外源DNA的重组分子数 / 载体分子总数在常规实验条件下，重组率一般为25 - 75% 重组率是衡量连接反应效率的重要指标，较高的重组率可以大大简化DNA重组的后续操作。2.提高重组率的方法 提高外源DNA片段与载体的分子比：2 : 1 - 10 : 1 载体DNA分子在连接前先除去磷酸基团： 5 5GAATTCCTTAAGGAATTCCTTAAGEcoRI5GCTTAA pAATTCG5 p5 GCTTAA OH 55 AATTCG5 HO退火5 G-A-A-T-T-CC-T-T-A-A

39、 G5G A-A-T-T-CC-T-T-A-A-GOHHOOHHO碱性磷酸单酯酶碱性磷酸单酯酶T4-DNA ligase 加装同聚尾末端： CTGCA 3 GG3 ACGTC5 GCATG 3C5C3 GTACGT4-DNA ligaseTdTTdTdCTPdGTPGCATGCCCCCC 3C退火C3 CCCCCCGTACGCTGCAGGGGGG 3 GG3 GGGGGGACGTC5 5GCATGCCCCCC GC GGGGGGACGTCCTGCAGGGGGG CG CCCCCCGTACG5 5GCATGCCCCCCTGCAGCGTACGGGGGGACGTCCTGCAGGGGGGCATGCGA

40、CGTCCCCCCGTACGKlenow同种内切酶产生的粘性末端的连接5 5GAATTCCTTAAGGAATTCCTTAAGEcoRI5GCTTAAAATTCG5 5 GCTTAA 55 AATTCG5 退火GCTTAAAATTCG5 GCTTAA 5 AATTCGGCTTAAAATTCG5 GCTTAA 5 AATTCGT4-DNA ligaseGAATTCCTTAAG5 5GAATTCCTTAAGGAATTCCTTAAG5 5GAATTCCTTAAGDNA分子重组的方法分子重组的方法同尾酶产生的粘性末端的连接BamHI5 5GGATCCCCTAGGGGATCCCCTAGG5GCCTAGGA

41、TCCG5 5 TACTAG 55 GATCAT5 退火GCCTAGGATCCG5 TACTAG 5 GATCATT4-DNA ligaseTGATCCACTAGG5 5GGATCACCTAGT5 TGATCAACTAGT5 BclIGCCTAGGATCCG5 TACTAG 5 GATCATTGATCCACTAGG5 5GGATCACCTAGT平头末端的连接 增加连接酶用量，通常为黏性末端连接用量的增加连接酶用量，通常为黏性末端连接用量的10倍；倍； 增加增加DNA平头末端的浓度；平头末端的浓度； 加入加入NaCl或或LiCl以及以及PEG； 适当提高连接反应温度；适当提高连接反应温度； AT

42、P浓度。浓度。不同粘性末端的连接BamHI5 5GGATCCCCTAGGGGATCCCCTAGG5GCCTAGGATCCG5 5 CTGCAG5 GACGTC3 T4-DNA ligaseCGATCCGCTAGG5 5GGATCGCCTAGC5 CTGCAGGACGTC5 PstI3 T4-DNA pol切平5 CG5 GCKlenow补平5GGATCCCTAGGATCC5 CTAGGCGATCCGCTAGG5 5GGATCGCCTAGC5 Klenow补补3 T4切切人工粘性末端的连接5GCCTAGGATCCG5 5 GCTTAA 555 AATTCGT4-DNA ligase5 5Klen

43、ow补平Klenow补平5GGATCCCTAGGATCC5 CTAGG5 GAATTCTTAA 555 AATTCTTAAGTdTTdTdGTPdCTPGAATTCCCCCCCTTAA AATTCCCCCCCTTAAGGGATCGGGGGGCCTAGGATCCGGGGGGCTAGGGAATTCCCCCCGATCCCTTAAGGGGGGCTAGGGGATCGGGGGGAATTCCCTAGCCCCCCTTAAG退火BamH IBamH IEcoR IBamH I5突出末端3突出末端CTGCA 3 GG3 ACGTC5 GCATG 3C5C3 GTACGT4-DNA ligaseTdTTdTdCTP

44、dGTPGCATGCCCCCC 3C退火Pst IPst IC3 CCCCCCGTACGCTGCAGGGGGG 3 GG3 GGGGGGACGTC5 5GCATGCCCCCC GC GGGGGGACGTCCTGCAGGGGGG CG CCCCCCGTACG5 5GCATGCCCCCC GC GGGGGGACGTCCTGCAGGGGGG CG CCCCCCGTACG5 5GCATGCCCCCCTGCAGCGTACGGGGGGACGTCCTGCAGGGGGGCATGCGACGTCCCCCCGTACG5 5GCATGCCCCCCTGCAGCGTACGGGGGGACGTCCTGCAGGGGGGCATG

45、CGACGTCCCCCCGTACGKlenowPst ISph I平头末端C 3 GG5 G 3C5C3 GT4-DNA ligaseTdTTdTdTTPdATPGTTTTTTTTTT 3C退火C3 TTTTTTTTTTGCAAAAAAAAAA 3 GG3 AAAAAAAAAAC5 5GTTTTTTTTTTGCAAAAAAAAAACCAAAAAAAAAACGTTTTTTTTTTGS1C3 5 5GTTTTTTTTTTGCAAAAAAAAAACCAAAAAAAAAACGTTTTTTTTTTG加热GTCATTTTTTTTTGAAAAAAAAACCAGTAAAAAAAAACTTTTTTTTTGTGA

46、CCAGT酶切位点的定点更换BamHI5 5GGATCCCCTAGGT4-DNA ligaseKlenow补平GATCC5 G5GCCTAG55 5GGATCCCTAG5 GATCCCTAGG55GGATCCCAATTGGGATCCCCTAGGGTTAACCCTAGG5 5EcoR ICCAATTGGGGTTAACCEcoR I linker 引入酶切引入酶切位点位点 在原有酶在原有酶切位点旁边切位点旁边引入另一个引入另一个酶切位点酶切位点 更换酶切更换酶切位点位点C 用于基因转移的受体菌或细胞各种基因工程受体的特性实验室常用的基因工程受体受体细胞应具备的条件受体细胞应具备的条件 限制缺陷型

47、重组整合缺陷型 具有较高的转化效率 具有与载体选择标记互补的表型 感染寄生缺陷型各种基因工程受体的特性1.大肠杆菌 遗传背景清楚，载体受体系统完备，生长迅速，培养简单，重组子稳定。2.枯草杆菌 遗传背景清楚，蛋白质分泌机制健全，生长迅速，培养简单。但遗传欠稳定，载体受体系统欠完备。3.链霉菌 抗生素的主要生产者，分子操作相对简便。但遗传不稳定，生长相对缓慢。4.酵母菌 具有真核生物的特征，遗传背景清楚，生长迅速，培养简单，外源基因表达系统完善，遗传稳定，但内源性蛋白产物种类繁多且含量高。5.昆虫细胞（家蚕） 具有真核生物特征，外源基因表达量高，繁殖较快，培养成本低廉，遗传稳定，但DNA重组操作

48、系统欠完善。6.哺乳动物细胞（中国仓鼠卵巢细胞 CHO） 与人的亲缘关系近，分子重组表达系统健全，具有合适的糖基化修饰系统，但细胞培养条件苛刻，生长缓慢。 7.植物细胞（拟南芥菜、烟叶） 农作物的经济意义重大，转基因植物细胞易于分化，细胞培养简单且成本低廉，但遗传操作繁琐。实验室常用的基因工程受体 大肠杆菌用于接受质粒：C600、W3110、HB101、JM83、JM101用于接受l-DNA：LE392、ED8654 酵母菌 哺乳动物细胞 CHO 毕赤酵母啤酒酵母2 2、DNA重组克隆的操作过程C 转化子的筛选和鉴定（检）B 重组DNA分子的转化和扩增（转、增）A DNA的体外重组（切、接）切

49、接转增检DNA重组克隆技术的工作流程A DNA的体外重组（切与接）同种内切酶产生的粘性末端的连接同尾酶产生的粘性末端的连接不同粘性末端的连接粘性末端的更换人工粘性末端的连接重组率B 重组DNA分子的转化和扩增（转与增）转化的原理与技术转化率转化细胞的扩增转化的原理与技术1.Ca2+诱导的完整细菌细胞的转化 Ca2+与细菌外膜磷脂在低温下形成液晶结构，后者经热脉冲发生收缩作用，使细胞膜出现空隙，细菌细胞此时的状态叫做感受态。 大肠杆菌感受态细胞的制备： 100 ml 菌体培养至OD600 = 0.5，离心收集菌体； 用10 ml 冰冷的10 mM CaCl2溶液悬浮菌体，离心收集菌体； 用1 m

50、l 冰冷的75 mM CaCl2溶液悬浮菌体； 冰浴放置12 - 24小时，备用。 大肠杆菌感受态细胞的质粒转化： 取100 ml 感受态细胞，加入相当于50 ng 载体的重组 冰浴放置半小时； 在42保温 2 分钟（热脉冲）； 快速将转化细胞转移至冰浴中放置1 - 2分钟； DNA连接液，混匀； 加入1 ml 新鲜培养基，于37培养 1 小时（扩增）； 涂在合适的固体培养基平板上进行筛选。 2.细菌原生质体的转化 革兰氏阳性细菌接纳外源DNA的主要屏障是细胞壁，因而这类细菌通常采用原生质体转化的方法转移质粒或重组DNA分子。酵母菌、霉菌、植物细胞也可用原生质体法进行转化。 不同细菌的原生质体

51、制备方法不尽相同，以链霉菌为例：细菌需生长在高渗培养基中（如34%的蔗糖溶液，并加入甘氨酸以增加细菌细胞壁对溶菌酶的敏感性）。在制备过程中，菌体应始终悬浮在10.3%的蔗糖等渗溶液中。与原生质体接触的所有器皿应保持无水无去污剂。 细菌原生质体的制备： 取0.2 - 1ml的原生质体悬浮液（108 8-109 9个原生质体），加入10 - 20 ml DNA重组连接液，同时加入含有PEG1000和Ca2+的等渗溶液，混匀。 细菌原生质体的转化：转化后的悬液涂在再生平板上让原生质体再生。3. l噬菌体DNA的转染 感受态细胞的培养 吸附 加入经体外包装好的重组噬菌体悬浮液，30保温10分钟。 转染

52、裂解 加入20倍体积的新鲜培养基，30培养2小时，直至培养液 中菌体裂解，培养液澄清度增加，然后涂板筛选。4.电穿孔转化 将待转化的质粒或DNA重组连接液加在电穿孔转化仪的样品池中，两极施加高压电场，在强大电场的作用下，细菌细胞壁和细胞膜产生缝隙，质粒或DNA重组分子便可进入细胞内。 同样的原理，电穿孔法也可用于质粒消除实验。转化率1.转化率的定义 每微克载体DNA在最佳转化条件下进入受体细胞的分子数。或每微克载体DNA转化后，受体细胞接纳DNA的个数，即克隆数。 例如，pUC18对大肠杆菌的转化率为108，即每微克pUC18中只有108个分子能进入受体细胞。一微克pUC18共有3.4X101

53、1个分子，也就是说，每3400个pUC18分子才有一个分子进入受体细胞。 另一方面，在实际操作过程中，转化一微克pUC18共需2ml感受态细胞，大约含有2X1010个大肠杆菌细胞，也就是说，每200个细胞只有一个细胞能接纳pUC18 DNA。2.转化率的用途 利用转化率和重组率等参数可以帮助设计DNA重组实验规模例如，某一DNA重组实验的重组率为20%，转化率为107/mg载体， 经切接处理后的载体转化率比天然的载体低100倍，欲获得104 4个 重组克隆，需投入多少载体DNA进行重组实验？ 若重组率为100%，则转化后产生104个重组克隆需要： 104 / 107 X 10 - 2 = 0.

54、1 mg 载体DNA 考虑到实验系统的重组率为20%，所以实际投入载体应为： 0.1 / 20% = 0.5 mg 载体DNA 载体投入量确定后，外源DNA的投入量即可按10 1的要求算出（5 mg）。 3.转化率的影响因素 载体及DNA重组分子方面： 载体本身的性质载体的空间构象插入片段的大小 受体细胞方面： 受体细胞必须与载体相匹配，例如：pBR322转化大肠杆菌JM83株，转化率很低；但对大肠杆菌ED8767株的转化率则较高。 转化方法方面： 受体细胞的预处理：影响最大供受体的比例：Ca2+诱导转化 0.1 ml 感受态细胞 50 ng DNA 转化方法：Ca2+诱导转化 106 - 1

55、07 / mg DNA 原生质体转化 109 个原生质体 50 ng DNA 原生质体转化 105 - 106 / mg DNA l-DNA转染 107 - 108 / mg DNA 电穿孔转化 106 - 109 / mg DNA 转化细胞的扩增1.扩增操作 转化细胞的扩增操作是指转化完成之后细胞的短时间培养。在实验时，扩增操作往往与转化操作偶联在一起。2.扩增操作的目的 增殖转化细胞，使得有足够数量的转化细胞用于筛选程序。 扩增和表达载体分子上的标记基因，便于筛选。 表达外源基因，便于筛选和鉴定。 C 转化子的筛选和鉴定（检）载体遗传标记检测克隆DNA序列检测外源基因产物检测 区分转化子与

56、非转化子、重组子与非重组子、目的重组子与非目的重组子。转化子重组子目的重组子载体遗传标记检测1.抗药性筛选法ROPROISal IBamH ITcrPvu IPst IPst IEcoR ICla IHind IIIHind IIBal IApr 抗药性筛选法的基本原理： pBR3224363 bpori抗药性筛选法可区分转化子与非转化子、重组子与非重组子。将外源DNA片段插在EcoRI位点： 非重组子呈 Apr、Tcr 重组子呈 Apr、Tcr 将外源DNA片段插在BamHI位点： 非重组子呈 Apr、Tcr 重组子呈 Apr、Tcs 抗药性筛选法的基本操作： 先将转化液涂布含有Ap的平板，

57、再将Ap平板上的转化子影印至含有Ap和Tc的平板上。 在Ap平板上生长、但在Ap和Tc平板上不长的转化子即为重组子。ApAp + Tc影印挑选2.营养缺陷型筛选法 营养缺陷型筛选法的基本原理： 营养缺陷型筛选法可以区分转化子与非转化子，一般不能区分重组子与非重组子。其原理是：载体分子上携带某种营养组分的合成基因，而受体细胞本身不能合成这一营养组分，将转化细胞涂布在不含此营养组分的培养基上，长出的便是转化子。 用于大肠杆菌的营养标记基因常选用色氨酸生物合成基因trp+。3.显色筛选法 显色筛选法的基本原理： 显色筛选法可以区分转化子与非转化子，也可区分重组子与非重组子。其原理是：载体分子上携带某

58、种显色酶基因，其表达产物能使细胞产生颜色反应，从而易于辨认和挑选，如大肠杆菌质粒pUC18携带的lacZ基因（蓝色反应）。 显色筛选法的基本操作： pUC18AprlacZoriAp + X-gal重组子（Apr + lacZ-） 将外源基因克隆在pUC18的lacZ标记基因内部，使之灭活，此时重组子呈Apr、lacZ-，白色菌落；而非重组子则呈Apr、lacZ+，蓝色菌落。 克隆DNA序列检测1.限制性酶切图谱法 对载体上插入的外源DNA片段进行酶切图谱分析，并以此与目的基因的已知图谱对比。可以区分重组子与非重组子，还能鉴定目的重组子。全酶解图谱法：pUC18 2.7 kbHindIII S

59、phI PstI SalI BamHI SmaI KpnI EcoRIAprlacZoriBBEP4.0 kb1.0 kb0.8 kb区分重组子与非重组子：用BamHI酶切转化子质粒DNA电泳观察酶解产物片段重组子： 2.7 kb + 4.0 kb非重组子： 2.7 kbpUC18 2.7 kbHindIII SphI PstI SalI BamHI SmaI KpnI EcoRIAprlacZoriSSBP4.0 kb1.0 kb0.8 kb经济因素pUC18 2.7 kbHindIII SphI PstI SalI BamHI SmaI KpnI EcoRIAprlacZoriBBEP4.

60、0 kb1.0 kb0.8 kb区分目的重组子与非目的重组子：用EcoRI酶切转化子质粒DNA目的重组子： 3.0 kb + 3.7 kb 或者： 1.0 kb + 5.7 kb用PstI酶切转化子质粒DNA目的重组子： 3.2 kb + 3.5 kb 或者： 0.8 kb + 5.9 kbBBPE1.0 kb0.8 kbpUC18 2.7 kbHindIII SphI PstI SalI BamHI SmaI KpnI EcoRIAprlacZoriBBE4.0 kb2.0 kb2.0 kb2.7 kb2.0 kbE2.菌落噬菌斑原位杂交法 根据克隆的目的基因或DNA片段的同源序列设计并合成

61、探针，以此搜寻筛选含有目的基因的目的重组子。其中，DNA同源序列之间的特异性互补杂交是该技术的基本理论依据。 菌落原位杂交法的基本操作：影印 用硝酸纤维素薄膜影印克隆平板； 洗涤杂交感光 用0.4N的NaOH溶液浸泡影印薄膜； 用SSC溶液浸泡清洗影印薄膜； 80烘干固定影印薄膜； 薄膜置于含有探针的杂交溶液中保温； 用SSC-SDS液洗涤杂交薄膜； 用X光胶片覆盖薄膜感光。 杂交探针的制备：用于菌落或噬菌斑原位杂交的探针必须满足下列条件：单链结构（双链DNA可用碱变性） 足够长度 内部不含互补区 探针的制备方法或来源包括：人工合成 cDNA合成 同源序列 GACCTAAAGCGGATCGTA

62、GGTCGACCTACTGGATAAGCTGGGC AmRNA 杂交探针的标记：5 HO3 HOOH 3 OH 5 T4-PNPMg2+ pppATP（g-32P-ATP）5 p3 HOOH 3 p 5 T4-PNP介导的末端标记逆转录酶介导的反转录标记3AAAAAAAAAAACCAGCTTCCGAACTGATTTAGGCT 5mRNA反转录酶Mg2+ dNTP + pppdATP（a-32P-dATP）5TTTTTTTTTTT5mRNA3cDNA3AAAAAAAAAAACCAGCTTCCGAACTGATTTAGGCT5TTTTTTTTTTTGGTCGAAGGCTTGACTAAATCCGADN

63、A聚合酶介导的缺刻前移标记5 G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-T 33 C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C-A 5 Mg2+ 5 dNTP 5 ppp dA（a-32P-dATP）5 G-C-T-C A-G-C-T-G-G A-G-T 33 C-G-A G-T-C-G-A-C-C-T-C-A 5 5 G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-T 33 C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C-A 5 DNase IDNA pol IABC荧光标记GCTTGAGCAGTAACCTG荧光胺Biotin 生物素Avidin生物素结合蛋白烷烃连接臂ABC显色酶标

64、记GCTTGAGCAGTAACCTG显色酶Biotin 生物素Avidin 生物素结合蛋白烷烃连接臂生色底物颜色产物地高辛系统标记dUTP-连接臂-甾醇半抗原digoxigenin DIG抗体-显色酶交联复合物3.DNA序列分析法 双脱氧末端终止测序法的基本原理： 在DNA聚合反应的进程中，通过位点特异性终止测定DNA序列。其关键技术有：DNA链聚合反应时的定点随机中断（ddNTP）聚丙烯酰胺凝胶电泳的高分辨率（600 bp / 601 bp）电脑自动检测、记录、编辑程序用于DNA测序的专一性试剂盒（Kit） 双脱氧末端终止测序法的基本操作： A C G T ssDNA ssDNA ssDNA

65、 ssDNA Primer Primer Primer Primer KlenowKlenowKlenowKlenowdNTPsdNTPsdNTPsdNTPsddATPddCTPddGTPddTTPA G T C DNA聚合反应聚丙烯酰胺凝胶电泳 双脱氧末端终止测序法的基本反应： KlenowOH 35 PTdNTP + ddATP TTTTTOH 35 PA G T C 5 GGCATTGCGTTACTAGTCCAGTACA 3外源基因产物检测1.蛋白质生物功能测定法 淀粉酶目的基因的鉴定： 目的重组子菌落周围会形成透明圈。 抗菌素抗性基因的鉴定： 理论上长出的菌落即是含有目的基因的目的重组

66、子。抗菌素抗性基因的鉴定目的重组子 诱导抗性 抽取重组质粒再次转化2.蛋白质生物结构鉴定法 放射免疫原位杂交鉴定： 影印 用固定了特异性抗体的聚乙烯薄膜影印洗涤与I125标记的IgG保温感光 轻轻漂洗影印薄膜，干燥固定； 与I125标记的IgG保温； 洗涤、干燥、感光。 用氯仿蒸汽或烈性噬菌体喷洒克隆平板； 含抗体的聚乙烯膜 裂解平板； 3.聚丙烯酰胺凝胶电泳法 待筛选鉴定的目标蛋白既不能测定生物活性，又无现成的抗体使用，采用聚丙烯酰胺凝胶电泳进行粗略的筛选。3 3、目的基因的克隆与基因文库构建C PCR法B cDNA法A 鸟枪法D 化学合成法E 基因文库的构建A 鸟枪法鸟枪法克隆目的基因的基本战略鸟枪法操作的改进鸟枪法克隆目的基因的局限性4. 筛选含有目的基因的目的重组子 鸟枪法克隆目的基因的基本战略 随机克隆供体细胞的全基因组DNA片段，然后通过快速有效的筛选程序从众多克隆中分离出含有目的基因的目的重组子，进而获得目的基因。1.染色体DNA的切断 2.与载体连接 3.转化受体细胞 鸟枪法操作的改进例如，已知某目的基因位于1.8 kb的SalI片段中，将染色体DNA用SalI切开，琼