艾滋病实验室生物安全

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1、 . . . . 艾滋病实验室生物安全HIV的生物危害 第一类、第二类病原微生物统称为高致病性病原微生物。人类免疫缺陷病毒HIV属第二类病原微生物，是高致病性病原微生物。HIV相关检测的生物安全级别 HIV抗体检测包括筛查和确证实验、抗原检测和相关的免疫学检测应在符合级生物安全实验室BSL-2要求的艾滋病检测实验室中进展。 HIV别离培养、浓缩、中和试验、细胞培养与研究工作与其它需要应用活病毒的研究工作，应在级生物安全实验室BSL-3中进展。 HIV核酸提取和检测均应在符合级生物安全实验室BSL-2要求的艾滋病检测实验室中进展。 HIV病毒株应保存在符合级生物安全实验室BSL-3要求的艾滋病实

2、验室；HIV阳性样品，包括全血、血清、血桨和其他组织液、核酸提取物应保存在符合BSL-2要求的艾滋病实验室。生物安全保证措施 建立安全制度实验室的安全工作制度或安全标准操作程序S-SOP。意外事故处理预案，主要是生物安全意外事故。容包括应急处理、登记和报告、调查和处理。信息安全与制度：与HIV/AIDS检测相关的所有资料均应严格，包括送检单、检测记录、样品登记、报告单与工作人员年度检测结果等，不得对无关人员透露检测结果。 培训和管理实验室应进展全员安全培训并强化“普遍性防护原那么安全意识，所有的血液、未固定的组织和组织液样品，均应视为有潜在的传染性，都应以安全的方式进展操作。所有管理和检测人员

3、都应承受省级以上艾滋病检测实验室主持的安全培训，包括上岗前培训和复训，并承受管理人员的监视。必须对新上岗人员进展安全教育和培训，使他们清楚实验室工作的潜在危险，通过考核等方式确认他们具备安全操作的能力后方可单独工作。必须对新调入人员、外来合作、进修和学习的人员进展生物安全培训，经实验室主任批准后，方可进入实验室。生物安全培训和监视应有客观详实的记录。实验室主任应详细了解所有工作人员的教育和培训背景、特长、性格特点等。要根据人员特点、工作种类、所涉与的生物材料合理安排工作区域，要定期对实验室环境进展安全检查。 个人保健和防护遇有手部皮肤有开放性伤口与其他不适于工作的情况，应暂停工作。皮肤的微小伤

4、口、擦伤等，应用防水敷料严密覆盖。应为每一名在艾滋病实验室工作的人员提供充足的防护服、一次性乳胶手套、口罩、帽子和覆盖足背的工作鞋。应将清洁的防护服和其他个人防护用品置于实验室清洁区的专用处存放。实验室应设置应急冲洗眼睛装置。工作人员上岗前必须进展HIV抗体和乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒等肝炎病毒标志物检测，应接种乙肝疫苗。应每年对工作人员采血检测HIV抗体，血清应长期保存。进实验室工作前要摘除首饰，修剪长的带刺的指甲，以免刺破手套。严禁在实验室进食、饮水、吸烟和化妆。实验操作时应穿适宜防护服白大衣、隔离衣或一次性工作服、戴手套和口罩、穿实验室专用的工作鞋。如接触物的传染性大、应戴双层手套；含有

5、HIV的液体样品或病毒培养液有可能喷溅时，应戴防护眼镜、穿防水如塑料围裙。工作完毕，先脱去手套，再脱去防护服，用肥皂和流动水洗手。穿过的污染的防护服应与时放入污物袋中，消毒后方可洗涤或废弃。操作过程中，如发现防护服被污染应立即更换，如手套破损，应立即丢弃、洗手并换上新手套。不能用戴手套的手触摸暴露的皮肤、口唇、眼睛、耳朵和头发等。不要将手套清洗或消毒后再次使用，因为使用外表活性剂清洗可使手套对水的通透性增加，消毒剂可以引起手套的破损。禁止使用口腔吸液管，必须使用移液器来操作实验的所有液体。 安全操作试剂与样品的管理应严格按要求妥善保存血清与其它体液样品，应按有关规定设立专门储存阳性血清、质控品

6、的血清库和/或毒种库，应上锁并指定专人管理。对存放试剂和有毒有害物质的区域应进展监控，冷藏柜、冰箱、培养箱和存放生物试剂、化学危险品、放射性物质的容器，置于工作人员视线之外的地点时应上锁。实验室的清洁和消毒工作完毕应对工作台面消毒，推荐用0.10.2%的次氯酸溶液消毒；用消毒液清洗后要枯燥20min以上；操作过程中如有样品、检测试剂外溅，应与时消毒。如有大量高浓度的传染性液体溅出，在清洁之前应先用1%的次氯酸钠溶液浸泡，然后戴上手套擦净。样品的采集和处理抽取静脉血液或以其它方式收集血液样品时要注意安全，应使用一次性注射器，戴手套，慎重操作，防止血液污染双手。应小心防止被针头和其它利器刺伤。如用

7、滤纸采样，应按常规将手指或耳垂局部消毒。刺破皮肤后，迅速把滤纸沾上，切勿让血液滴落在其它物体外表造成污染。采血后待血样枯燥后再包装送检。离心样品时要使用密闭的罐和密封头，防止离心时液体溢出或在超/高速离心时形成气溶胶。样品的带入、带出和操作不得将非实验室物品带入实验室。包装有测试样品的包裹应在实验室的安全柜打开，不能在收发地点或仓库等地点打开，同时，打开包裹的人员应承受过处理感染源方面的训练并穿戴适宜的防护服；实验室应具有处理感染源的设备并准备好可消毒的容器。打开样品容器时要小心，防止容物泼溅。要核对样品与送检单，检查样品管有无破损和溢漏。如发现溢漏应立即将尚存留的样品移出，对样品管和盛器进展

8、消毒，同时要按照程序报告有关负责人。要检查样品的状况，记录有无严重溶血、微生物污染、血脂过多以与黄疸等情况。如污染过重或者认为不能承受，那么应将样品用安全方式废弃，同时将情况通知送样人。常规处理血液、体液样品可在工作台上进展，如样品有可能溅出，那么应戴手套、口罩和防护眼镜，在生物安全柜中操作。将样品转送到其他实验室时，应防止对工作人员、患者或环境造成污染。护送样品的人应清楚接收地点和接收人，实验室负责人或其指定的人员应与时确认样品已送达指定的实验室，被转入安全位置并得到妥善处理。被污染或可能污染的材料在带出实验室前应进展消毒。用后的包裹应进展消毒。用于国际空运的样品要按照国际空运协会IATA的

9、规那么进展包装和标记，并提交相应的资料。 使用利器考前须知应尽量防止在实验室使用针头、刀片、玻璃器皿等利器，以防刺伤。如果必须使用，在处理或清洗时应采取措施防止刺伤或划伤，并应对用过的物品进展消毒。应使用安全针具采血，如蝶形真空针，自毁性针具等，以降低直接接触血液和刺伤的危险性。应将用过的锐器直接放入耐穿、防渗漏的利器盒，用过的针头应直接放入巩固的容器，消毒后废弃禁止将使用后的一次性针头重新套上针头套。禁止用手直接接触使用过的针头、刀片等利器。污染物处理艾滋病实验室产生的所有废弃物，包括不再需要的样品、培养物和其它物品，均应视为感染性废弃物，应置于专用的密封防漏容器中，安全运至消毒室，经高压消

10、毒后再进展处理或废弃。 艾滋病检测实验室常用的消毒方法物理消毒方法高压蒸汽消毒，121，保持1520min; 枯燥空气烘箱消毒干烤消毒140，保持23h。化学消毒方法含氯消毒剂次氯酸钠，含有效氯20005000mg/L 75%乙醇 2%戊二醛艾滋病检测实验室物品常用的消毒方法废弃物缸：5000mg/L 次氯酸钠。生物安全柜工作台面和仪器外表：75%乙醇。溢出物：5000mg/L次氯酸钠。污染的台面和器具：2000mg/L 次氯酸钠,也可以用过氧化氢或过氧乙酸。器械可用2%戊二醛消毒。生物安全柜 生物安全柜处理危险性微生物时所用的箱型空气净化安全装置。 I类生物安全柜至少装置一个高效空气过滤器对

11、排气进展净化，工作时柜正面玻璃推拉窗打开一半，上部为观察窗，下部为操作窗口。外部空气由操作窗吸进，而不可能由操作窗口逸出。工作状态时保证工作人员不受侵害，但不保证实验对象不受污染。 类生物安全柜至少装置一个高效空气过滤器对排气进展净化，工作空间为经高效过滤器净化的无涡流的单向流空气。工作时柜正面玻璃推拉窗打开一半，上部为观察窗，下部为操作窗口。外部空气由操作窗吸进，而不可能由操作窗口逸出。工作状态下遵守操作规程时既保证工作人员不受侵害，又保证实验对象不受污染。 CLASS II 级生物安全柜 CLASS II 级生物安全柜根据结构以与气流分配不同主要是外排气流不同分为： A型:30%排在室 B

12、型: B1 70%接收道外排 B2 100%接收道外排 B3 30% 接收道外排CLASS II A 生物安全柜生物安全柜的使用位置操作人员意外事故处理发生意外事故时，应针对事故的类型立即进展紧急处理，主要包括：皮肤针刺伤或切割伤，应立即用肥皂和大量流水冲洗，尽可能挤出损伤处的血液，用70%乙醇或其它消毒剂消毒伤口。皮肤污染：用水和肥皂冲洗污染部位，并用适当的消毒剂浸泡，如70%乙醇或其它皮肤消毒剂。粘膜污染：用大量流水或生理盐水冲洗污染部位。衣物污染：尽快脱掉污染的衣物，进展消毒处理。污染物泼溅：小围污染物泼溅，应立即进展消毒处理和清洗。发生大围污染物泼溅事故时，应立即通知实验室主管领导和安

13、全负责人到达事故现场，查清情况，确定消毒的程序。发生空气污染时，可采用低温蒸汽甲醛气体对空气进展消毒，但甲醛有致癌作用，不宜用于生物安全柜和实验室的常规空气消毒。如果发生重大泼溅事故，应采取以下措施进展：从污染处疏散人员，但要防止污染扩散；控制污染扩散，锁门并禁止人员进入；通知实验室主管领导、安全负责人等，查清情况，确定消毒处理的程序；必要时可进展生物安全柜和/或实验室的低温蒸汽甲醛气体消毒，使用这种方法生物安全柜和/或实验室必须密闭，人员必须离开。具体操作可按说明书执行。溢漏处可用经消毒剂浸泡的吸水物质覆盖；消毒剂作用1015分钟后，移走吸水性物质，用消毒剂冲洗，用水清洗。意外与事故的登记、

14、报告和检测对重大意外和事故必须进展登记，对职业暴露事故应填写“艾滋病职业暴露人员个案登记表。对重大意外和事故必须进展报告和检测步骤1：确定暴露级别步骤2：确定HIV传染源头严重程度哪些情况暴露不会导致HIV感染由于职业暴露而导致的HIV感染的概率是很小的，并不是每一次职业暴露都会导致HIV感染的发生，许多情况下可以不必过度紧担心，如：1经证实接触的可疑血液或体液为HIV阴性；2完整无损皮肤或无新鲜流血的旧性伤口等接触HIV阳性血液、感染性体液；3完整无破损皮肤或无新鲜流血的旧性伤口等接触HIV阳性血液、感染性体液且与时冲洗消毒后；4完整粘膜或皮肤粘膜结合部短时接触少量、低滴度如HIV血浆浓度低

15、于1500拷贝/毫升HIV阳性血液或感染性体液；感染风险 应将职业暴露补救防护药品放在医务人员24小时都能拿取的地方。 保证有足够的医疗防护用品贮存，并能随时取用。 要求医护人员在发生职业暴露的第一时间按照处置流程进展防护，并与时报告感染办进展职业暴露备案登记存档管理。 规建立健康档案，定期免疫接种。 加强过程控制中相关细节的管理 改善洗手条件：配备感应或脚踏式洗手装置，以洗手液替代肥皂。 洗手标准化：将洗手的步骤、时间以图示方式贴于洗手处。 医疗废物严格按分类处理，明显标识，双层包装，防渗漏，防遗撒。 锐器置入锐器盒。 制定减轻职业压力的策略 新职员安全操作培训 建立暴露后预防和普遍性应急预

16、防方案案例提示 1、在处理一次性医疗用品时，要将针头、刀片等锐器与其它物品分开存放和处理，锐器等要装在耐刺的朔料桶中，以免发生被混在污物中的锐器扎伤等事故。 2、暴露级别为2级，暴露源级别为重度类型； 3、在发生职业暴露后马上进展局部紧急处理是对的； 4、发生职业暴露后，最好在4小时服药，即使超过了24小时仍然要服药。案例提示 1、在临床工作中，尤其在为艾滋病人的医疗操作中，一要注意戴口罩，二要戴防护眼镜。 2、这属于粘膜的暴露，不要用眼药水滴眼，否那么容易损伤粘膜，增加感染的机会。 3、在暴露源不明时，先采取必要的预防措施，待暴露源明确后，要根据暴露级别和暴露源类型重新调整用药方案。艾滋病的

17、流行与实验室诊断一、艾滋病简介二、艾滋病流行现状全球、全国、全省三、艾滋病实验室诊断四、实验室质量控制五、生物安全与职业暴露预防一、艾滋病简介人类免疫缺陷病毒 (HIV) 获得性免疫缺陷综合症 (AIDS) 的病原体 慢病毒属的逆转录病毒 感染和破坏CD4+ T淋巴细胞，导致免疫系统的损害 HIV-1亚型：A-JM，O和N HIV-2亚型：A-FHIV的传播史 来自猿猴免疫缺陷病毒 (SIV) - 1700 B.C. 从 SIV 别离出HIV-1 - 1930s AIDS 可能开始於非州-1950s 首次报导於中非- 1981 散播到中美，美国，欧州HIV 的构造 Gp120 壳糖蛋白 Gp4

18、1 壳糖蛋白 P17 基质蛋白 P24 膜蛋白 逆转录酶 蛋白酶 脂质膜层病毒DNA嵌入细胞核的DNA 接合体液可能感染 脑脊髓液 滑膜液 胸膜液 腹膜液 心包液 羊膜液 脓体液中 HIV含量 传染源：艾滋病人与艾滋病毒携带者 易感人群所有人高危人群：1 、多性伴人群，如嫖娼卖淫、同性恋2 、经常使用或接触血液者，如血友病人、受血者3 、注射吸毒者4 、性病病人5、艾滋病毒感染者的配偶、子女6 、艾滋病人的密切接触者，如医务人员二、艾滋病流行现状全球、全国、全省报告HIV的传播途径构成流行特点 传播方式复杂隐蔽 90年代初期，仅在援外人员中发现艾滋病感染者 90年代中期，出现了经采供血感染和注

19、射毒品感染的病例-90年代后期，又发现了经性接触传播的病例-艾滋病传播的三种途径在我省都已出现HIV/AIDS: 报告人数仅为冰山一角今天艾滋病在中国流行的形势三、艾滋病实验室诊断诊断的重要性 与时发现和治疗，延长生命 进展防治教育，改变高危行为、预防进一步传播和职业暴露 减低母婴传播的危险性 早期治疗，保障和稳定免疫系统的应答功能检测 病毒 -检定抗体，抗原 -病毒核酸 (DNA/RNA) 免疫系统 CD4 计数检测 HIV 的血清学检测急性期 病毒量与抗体非急性期 抗体 HIV 感染者的监测病毒量与 CD4 计数的追踪检测窗口期 感染后，血液 HIV 检测结果阴性期间 90% 感染者在暴露

20、3个月后，检测结果阳性 10% 在暴露后3至6个月间，检测结果阳性HIV 抗体的检测: 检测的可靠性 假阴性: 输血者1/251,000(0.0004%) 结果假阴性的原因 - 窗口期: 期限中数，1个月；很少6个月- HIV-1 分类亚型 (Subtype O)- 不正常的机体反响 结果错误的最主要原因：电脑和工作人员的错误 意料外的结果应重复检测急性期/早期感染HIV抗体的适当检测时间 - 基线(Baseline) - 暴露后6 周 - 暴露12 周 - 暴露后26 周暴露六个月后，病毒抗体检测结果大致已转阳性艾滋病EIA方法开展病毒量 检测血液中病毒量 (计数/亳升) PCR (多聚酶链

21、锁反响) 或 bDNA 能影响开始药物治疗的时间与药物的选择 (假设病毒量100,000/毫升,能预测病症的开展 容许三倍的误差存在：例如30,000可算是介乎10,000与90,000间的任何可能数值 同时发生的疾病和新近的疫苗注射可使检测结果反常 治疗的目标: 病毒量低于测量的限度 “测不到,= 50/亳升核酸检测对血液安全的影响 意大利93家血液中心开展核酸检测2001年至2006年6年来对血液安全的影响结果。资料来源：Transfusion. 2008 Oct;48(10):2205-13各种诊断检测法的检定 HIVCD4 计数 单位: 计数/毫升或淋巴细胞中CD4的百分比% 正常计数

22、: 600-1200 典型的下降: 50-100/年 - CD4是评估病人的至关重要的根底- 是确定HIV感染开展、抗病毒治疗、预防机会性感染的依据 当CD4200，大多数感染开始 同时患有其他疾病和新近的疫苗注射可使检测结果反常 定期追踪检测是关键AIDS 的正式诊断 CD4 200或 AIDS 的临床表现从 HIV 到 AIDS 不能治愈 药物可局部治疗免疫缺陷并发疾病 药物可抑制病毒，延长寿命 作病毒量 (Viral Load) 和免疫系统 (CD4计数) 的追踪检验四、实验室质量控制室质量控制 试剂盒部对照：阳性、阴性对照 室质控品：外部质控品。以此数据绘制质控图 -Levey-Jen

23、nings质控图是最常用的质控图，该图使用累计和技术或趋势分析技术的图形提供系统偏移和漂移的状况。 -“即刻法质控方法是在对同一批外部质控血清连续测定3次后，即可对第3次检验结果进展质控。Levey-Jennings质控图绘制 在常规条件下，对同一批血清连续测定20次天或以上，获得一组S/CO值，求均数和标准差s, 超出2s或3s的数据不应删除。 将均值和标准差s分别在质控框架图中标示出来。以S/CO值作纵座标Y轴，每一批次试验作横座标x轴，绘制质控图。 从第21次起，将每次质控血清的检测结果依次点入该质控框架图中，检验进入质控状态。实验室质量考评 质量控制是对从样品接收到发出报告整个过程每个

24、环节的管理过程，包括： -人员能力； -实验室分区和环境； -仪器设备； -检测过程试剂、操作过程，外部质控品使用。考评方式 问卷调查与相关信息收集 发放外部质控样品 现场检查 反响与通报五、生物安全与职业暴露预防生物安全保证措施 建立安全制度 培训和管理 个人保健和防护 安全操作 使用利器考前须知 污染物处理 意外事故处理职业暴露后处理原那么 与时原那么 报告原那么 原那么 知情同意原那么职业暴露后预防 局部急救 对暴露级别的评估 对暴露源的评估 预防性用药 报告与HIV抗体的实验室检测n 本章规定了HIV抗体的检测方法、程序、结果报告、检测策略与质量控制。适用于各级各类医疗机构、疾病预防控

25、制机构、检验检疫机构、采供血机构与卫生保健机构。可作为对HIV感染者诊断和监测的实验室依据。n HIV抗体检测实验室要求n 应符合全国艾滋病检测工作管理方法2006年版中对检测实验室人员、建筑设施和设备等条件的要求。n 应符合实验室生物安全通用要求GB 19489-2004对II级生物安全实验室BSL-2的各项要求。n 实验室安全按本规第八章规定执行。n 实验室的质量保证按本规第九章规定执行。HIV抗体检测的目的HIV抗体检测可用于诊断、血液筛查、监测等。n 以诊断为目的的检测是为了确定个体HIV感染状况，包括临床检测、自愿咨询检测、根据特殊需要进展的体检等。n 以血液筛查为目的的检测是为了防

26、止输血传播HIV，包括献血员筛查和原料血浆筛查。n 以监测为目的的检测是为了解不同人群HIV感染率与其变化趋势，包括各类高危人群、重点人群和一般人群。n 研究HIV抗体检测的要点n 根据目的选择检测方法与检测策略。n 严格遵守实验室SOP。n 筛查试验阳性，须作确证试验。n 筛查试验阴性，不应做确证试验。n 筛查与确证试验阳性均应做好咨询工作。达到保证措施的必要条件n 贯彻有关HIV检测的法规n 有效的检测方法和检测试剂n 常规质量控制和质量保证全国艾滋病检测工作管理1990. 全国HIV检测管理规试行1997.9. 全国艾滋病检测工作规2003.5. 全国艾滋病检测技术规试行 - “规 -“

27、方法？2004.8 全国艾滋病检测技术规2009.9 全国艾滋病检测技术规修订版2006.6 全国艾滋病检测工作管理方法 - “方法艾滋病检测实验室检测信息上报n 各级艾滋病检测实验室所在机构每月应填写HIV抗体检测数与阳性人数统计报表附表6，并于每月10日前完成网络直报。未开展网络直报的单位，由县级疾病预防控制机构收集信息后统一上报。HIV感染的实验诊断n 检测方法n HIV培养，核酸测定，P24抗原检测，血清抗体测定n 金标准n 血清HIV抗体测定，HIV感染后平均25天检出，待12周时几乎全检出n HIV抗体检测n 两个阶段筛查和确证n 三个程序筛查复检确证n 五种标本血清，血浆，滤纸干

28、血斑，唾液，尿液，HIV感染后的血清学动态血清学检测标准的血清学检测指用EIA进展筛查，然后用免疫印迹实验WB进展确证。EIA筛查实验需要重复，复测阳性是做WB检测的指征。n 如果抗原抗体联合试剂检测呈阳性反响，而抗体试剂检测为阴性反响，那么应进展随访，必要时考虑进展HIV-1 p24抗原或核酸检测。 HIV抗体筛查n - 筛查-出具“HIV抗体阴性报告n 筛查+出具“HIV抗体待复检，n 不能出阳性报告n - 复查n 填写“HIV抗体复检检测单，两人签字检验人员、审核人员n 重新采集受检者的血样n 原样和新样连同送样单送确证实验室n 做好检测前后咨询n 初筛试验结果的报告n 对HIV抗体筛查

29、试验，呈阴性反响者可出具HIV抗体阴性报告可用附表1；对初筛试验呈阳性反响者不能出阳性报告，可出具“HIV抗体待复检报告附表1。n 初筛试验呈阳性反响样品的转送n 如需送上级实验室进展确，需要填写“HIV抗体复检检测单附表2，经1名检验人员和1名具有中级以上技术职称的人员审核签字。送当地艾滋病筛查中心实验室，再转送艾滋病确证实验室。检测的方法一、检测HIV抗体筛查方法1.酶联免疫吸附试验ELISA/EIA2.化学发光或免疫荧光试验3.快速检测RT与其它检测试验明胶颗粒凝集试验PA免疫渗滤试验免疫层析试验n 二、确证试验方法n 免疫印迹试验Western Blot)n 条带免疫试验n 放射免疫沉

30、淀试验RIPAn 免疫荧光试验IFA等。酶标免疫技术(EIA)人员培训ELISA原理；临床意义；熟悉检测技巧，熟悉检测试剂性能包括试剂盒组成，包被片段与其组成；熟悉检测仪器的原理与性能；掌握数据处理的能力和质量控制知识。需经有关部门组织的专门培训班，考试合格后持证上岗。方法n 间接法 Ag+AbAg-Ab Ag-Ab+IgGn 竞争法 Ag+Ab/Abn 夹心法 Ag+AbAg-Ab Ag-Ab+Agn ELISA检测试剂根据其设计原理、抗原制备难易和历史开展可粗分为四代。n 第一代产品是使用HIV全病毒裂解物为抗原，应用间接法原理检测HIV抗体；n 第二代产品是使用在细菌或真菌中表达的人工重

31、组或化学合成多肽HIV抗原，应用间接法原理检测HIV抗体。n 第三代试剂使用合成多肽HIV抗原少数用重组抗原，应用双抗原或双抗体夹心法原理检测HIV抗体或抗原。n 第四代试剂是已超出只查抗体的传统酶联方法，可同时测出抗体和抗原。每一代 HIV EIA 试剂实验原理HIV “窗口期第一代 HIV Ab: 6 - 8 星期酶联免疫试剂操作步骤试剂盒选择n 必须使用经国家食品药品监视管理局注册批准、批批检合格、在有效期的试剂，试剂应从灵敏度，特异性，精细度，稳定性，简便性，安全性与经济性作出全面的评价。n 敏感性:是该方法能够检测出最弱阳性标本的能力，真阳性数敏感度= 100%真阳性数+假阴性数n

32、特异性：是该方法能够检测出真阴性标本的能力。真阴性数特异度= 100%真阴性数+假阳性数n 精细度：ELISA试剂一般指其批CV，其值应小于15%；定量试剂应同时考察线性围试剂盒选择n 稳定性：试剂在规定条件下能储存的时间，一般采用破坏性试验即将试剂存放于37保存，定期测定其灵敏度，特异性和精细度等指标，直到其质量指标开始下降为止，通常认为37每稳定一天相当于4-10保存一个半月。n 简便性：指在不影响试剂的前三项指标的前题下，实验和测定步骤越少越好，在定性试验中结果判断简单明了，定量试验结果计算也应简单。n 安全性：指试剂对操作者和环境安全无害无传染性。n 经济性：试剂在同等质量条件下通过大

33、规模生产或技术进步降低本钱而市场价格比拟合理。n 通过询问试剂包被物的组成，如原料来源基因工程或合成多肽，片段的组合按比例混合或化学合成，片段的长短等判断试剂的优劣；n 试剂评价需要有权威的血清考核盘Panel进展检测，由于Panel一般实验室不易取得，每进展一次试剂评价也很麻烦。可以通过间接的信息对试剂进展选择。根据权威部门发布的试剂评价结果，了解市场上试剂的质量优劣。如参考中国CDC AIDS参比实验室组织的全国HIV抗体诊断试剂临床质量评估结果对试剂进展选择。仪器质控n 为使仪器保持最正确工作状态应建立维护和校正仪器的标准操作程序SOP，所要控制的仪器包括移液器加样枪，水浴箱温箱，洗板机

34、和酶标仪。n 移液器：ELISA加样量小5-100l，其准确性直接影响实验结果，利用称重法检查：吸取刻度指示量的水，万分之一天平称重后计算吸量是否准确，一般应在10%以；n 水浴箱 经常检查水浴箱温度计所示的温度和水中或温箱实测温度是否一致，允许有1的误差；n 洗板机 每个厂家设置洗板后的残留液有各自的规定一般不超过2ul ，人工扣板时，垫纸不湿，定期检查管孔是否堵塞；n 酶标仪 经常维护其光学局部，防止滤光片霉变，定期检测校正，使其保持良好的工作性能。EIA结果判断n OD值各孔OD值是通过某一波长的一束光自上而下照射，并检测被液体吸收的光的量。n Cut-off值临界值是将检测的阳性和或阴

35、性对照的OD值代入厂商提供的计算公式计算出来的判断阳性和阴性结果的界值。不同厂商、不同方法的试剂临界值计算公式不同。EIA结果判断n 有反响：样本的OD值CUTOFF值n 无反响：样本的OD值CUTOFF值n 不确定灰色区：CUTOFF值上下10%灰区概念n 把定量分析的正常值围引入定性分析建立灰区概念，即将CO值上下的一段区域定为阳性可疑，需重复实验或换试剂重测以确定其阴阳性，如仍落在灰区围那么报告+阳性。 灰区概念对血站系统的献血员筛查尤为重要。n 灰区的设置有二种：1C.O1CV， CV为该试剂的批CV (一般在15-20%间；2C.O2s，s为实验室做室质控ROC的s。EIA影响因素n

36、 反响时间n 温度n 酶结合物的稳定性影响ELISA试验效果常见问题原因分析与解决方法影响ELISA试验效果常见问题原因分析与解决方法影响ELISA试验效果常见问题原因分析与解决方法EIA试验的优缺点化学发光或免疫荧光试验n 这类试剂采用发光或荧光底物，既可检测抗体，也可联合检测抗原抗体。HIV抗原或抗体包被于固相载体，参加待检样品和酶或荧光标记的HIV抗原或抗体，加发光或荧光底物，用发光或荧光仪测定结果。有效试验的阴性和阳性对照必须符合试剂盒规定。快速检测RT与其它检测试验n 明胶颗粒凝集试验PA：是HIV血清抗体检测的一种简便方法。将HIV抗原致敏明胶颗粒作为载体，与待检样品作用。当待检样

37、品含有HIV抗体时，明胶颗粒与抗体发生凝集反响，根据凝集情况判读结果。PA试剂有两种:同时检测HIV-1和HIV-2抗体以与分别检测HIV-1和HIV-2抗体。有效试验必须有阴性和阳性质控。凝集试验与ELISA的原理比拟凝集试验与ELISA操作步骤的比拟小结n 操作简便，不需任何辅助设备n 可以单人份操作n SFD HIV 1/2PA可同时检测HIV-1型包括O群和HIV -2型抗体。n 由于使用了重组抗原与明胶颗粒凝集技术，试剂的敏感性和特异性均较高。对HIV血清转化盘的研究显示：敏感性与酶免法相当特异性高于99.8% n 免疫渗滤试验：斑点ELISA和斑点免疫胶体金或胶体硒快速试验：均以硝

38、酸纤维膜为载体，HIV抗原点状固定在膜上，加待检样品。阳性结果在膜上抗原部位显示出有色斑点。反响时间在10分钟以。有效试验的质控点必须显色。n 免疫层析试验：以硝酸纤维膜为载体，HIV抗原线状固定在膜上，待检样品血液或唾液沿着固相载体迁移，阳性结果在膜上抗原部位显示出有色条带。有效试验的质控带必须显色。n 此法操作简便，不需特殊仪器，出结果快，特别适合在未产前检查的分娩孕妇、高危行为的求诊者、输血前的急诊者、遥远地区供血者、VCT、急诊室、解剖室、殡仪馆以与意外暴露时追踪传染源等情况下使用。对于实验条件差，技术人员水平较低的开展中国家也较适用。但其敏感性、特异性均较ELISA法低，且检测结果结

39、果用肉眼判读，易受主观因素的影响，不同的检验人员观察同一个结果可能会得出不同的结论，弱阳性结果常常较难判别。对筛查结果的解释n 筛查检测的目的是检出所有的阳性者，因此对筛查试剂的质量要敏感性必须好，在注重强调敏感性的情况下，特异性不可防止地受到影响。出现假阴性或假阳性结果，同时还有可能出现的技术误差等等。因此分析筛查结果时，必须全面考虑。解释结果要十分慎重，这也是为什么筛查实验的阳性结果不能最终确定为HIV抗体阳性，必须做确证实验才能下结论。假阳性结果n 一些含有针对HLA抗原的抗体n 患自身免疫性疾病如系统性红斑狼、风湿病等n 寄生虫如疟疾等n 其他病毒如病毒性肝炎等n 近期疫苗接种如流感疫

40、苗接种等n 高丙种球蛋白症技术误差实验中出现技术误差是难免的，特别是在一次做大批量检测时。n 血清标本或试剂稀释或配备不正确n 加样器污染或不正确n 加错标本n 临近孔交叉污染n 洗涤程序错误n 吸光检测不正确假阴性结果n “窗口期感染者n 严重的HIV相关免疫紊乱者血清转换期：一些病人在病程的晚期发生血清学转换，可能由于免疫系统的崩溃所致；也可能于HAART治疗导致免疫重建的病人n IgG抗体缺乏者n 抗原量过量对确证结果的解释n WB的检测结果是在转印条膜特异性HIV抗原的位置上出现深浅不同的条带，按照不同的的带型，最终结果可以判断为HIV抗体阳性、HIV抗体阴性、HIV抗体不确定。n H

41、IV抗体阳性：说明是真正感染了HIV，为HIV感染者或AIDS。n HIV抗体阴性：未感染HIV “窗口期感染者对确证结果的解释 HIV抗体不确定：是一个比拟令人困惑的问题。不仅筛查阳性的标本可以出现不确定的结果，筛查阴性的标本做WB检测时也有大约15%出现一个或几个抗原的不确定结果。n 早期感染：有过HIV感染危险行为的个体。处在血清转换的过程，出现P24最多见，23个月以后可以显示确切的阳性反响。在WB条带中，P24、P31和P55比单独P17 预示早期感染的价值高得多。对确证结果的解释n AIDS病人：在病程的晚期，可能丧失对P24抗原和其他抗原的反响性而表现为持续的不确定结果。n 非特

42、异性反响：共同抗体的交叉反响，多见于胶原-血管疾病，自身免疫性疾病、恶性肿瘤、高球蛋白血症与其他病原微生物感染等。对不确定结果如何处理n 不论是哪种可能都应进展随访，结合流行病学资料，可以在4周后随访检测，如带型没有进展或呈阴性反响，那么报告阴性；如随访期间出现阳性反响，那么报告阳性；如随访期间带型有进展，但不满足阳性标准，应继续随访到8周。如带型没有进展或呈阴性反响那么报告阴性；满足HIV抗体阳性诊断标准那么报告阳性，不满足阳性判断标准可视情况决定是否继续随访。对不确定结果如何处理n 随访期间可根据需要，检测病毒核酸或P24抗原作为辅助诊断。如果出现HIV-2型的特异性指示条带，根据实际情况

43、需用HIV-2型免疫印迹试剂再做HIV-2的抗体确证试验或HIV-2核酸检测，以进一步明确HIV-2感染状态，疑难样品送国家艾滋病参比实验室进一步分析。n chinaids.orgn 检测与咨询n 全国艾滋病检测技术规2009年修订版全国艾滋病检测工作管理方法n 共八章三十五条n 本方法由卫生部负责解释，自发布之日起施行二六年六月十二日n 本管理方法适用于全国所有开展艾滋病检测工作的机构第一章总那么n 目的：为加强对全国艾滋病检测工作的监视管理，规艾滋病检测实验室的设置和验收，确保艾滋病检测工作质量n 依据：中华人民国传染病防治法、艾滋病防治条例和国家相关法律、法规的规定，n 卫生部对1997

44、年颁布的全国艾滋病检测工作规进展了补充修改,制订了全国艾滋病检测工作管理方法n 卫生部主管全国艾滋病检测与其监视管理工作，n 县级以上地方卫生行政部门主管辖区的艾滋病检测与其监视管理工作。n 中国疾病预防控制中心与各省、自治区、直辖市疾病预防控制中心承当艾滋病检测的日常管理工作。n 各级疾病预防控制机构、医疗机构、采供血机构、计划生育技术服务机构等承当职责围的艾滋病检测工作，并承受中国疾病预防控制中心与省、自治区、直辖市疾病预防控制中心的业务指导。第二章艾滋病检测实验室的设置n 省级以上卫生行政部门根据医疗卫生机构布局和艾滋病流行情况，统筹规划确定承当艾滋病检测工作的实验室。n 国家对艾滋病检

45、测实验室实行分类管理，按照实验室的职能、开展检测工作的性质与围共分三类实验室，分别是艾滋病参比实验室、艾滋病检测确证实验室、艾滋病检测筛查实验室。艾滋病参比实验室n 艾滋病参比实验室设在中国疾病预防控制中心。其职能包括：1、承当全国艾滋病检测实验室网络建设的业务技术指导和评价工作。2、建立全国艾滋病检测质量保证与质量控制体系，组织国家级实验室能力验证和艾滋病诊断试剂临床质量评估。3、承当艾滋病检测疑难样品的分析和确证，对有争议的检测结果进展仲裁，出具最终检测报告。 4、开展应用性研究，承当与艾滋病防治相关的病原学鉴定、现场综合防治、调研、监测、临床治疗等工作中的相关检测任务。 5、建立国家艾滋

46、病病毒毒种库、样品库、质控品库、基因库和细胞库。 6、为艾滋病确证中心实验室开展省级实验室质量管理、省级艾滋病诊断试剂临床质量评估和自愿咨询检测等工作提供技术支持和指导。 7、组织全国艾滋病检测相关业务培训，组织制定和修改与艾滋病检测工作有关的技术规和指南。艾滋病检测确证实验室n 包括艾滋病确证中心实验室和艾滋病确证实验室。n 艾滋病确证中心实验室设在省级疾病预防控制中心。n 艾滋病确证实验室可设在疾病预防控制机构、医疗机构、血液中心、计划生育技术服务机构等。艾滋病确证中心实验室职能n 负责职责围艾滋病检测实验室网络建设的业务技术指导和评价，组织艾滋病检测实验室人员技术培训。n 建立艾滋病检测

47、实验室质量控制体系，组织省级实验室能力验证和艾滋病诊断试剂的临床质量评估。n 承当省级卫生行政部门指定区域的艾滋病病毒抗体确证、抗体筛查和其他艾滋病检测工作。n 开展应用性研究，承当与艾滋病防治相关的病原学鉴定、现场综合防治、调研、监测、临床治疗等工作中相关的检测任务。n 建立职责围的艾滋病检测样品库和质控品库。n 收集、整理和分析艾滋病检测数据与相关资料，建立艾滋病检测实验室根本资料库和艾滋病检测资料数据库。定期向省级卫生行政部门和中国疾病预防控制中心报告艾滋病检测数据与相关资料，并配合其做好个案调查、登记等随访工作。n 负责对开展自愿咨询检测工作的艾滋病检测实验室的技术支持和指导。艾滋病确

48、证实验室职能n 承当当地卫生行政部门指定的艾滋病病毒抗体确证、抗体筛查和其他艾滋病检测工作。n 与时向艾滋病确证中心实验室报告经确证的阳性结果，并配合其做好个案调查、登记等随访工作。n 承当当地卫生行政部门指定的艾滋病检测筛查实验室的业务技术指导、培训和评价任务。n 定期汇总艾滋病检测资料，并上报艾滋病确证中心实验室和同级卫生行政部门。n 协助艾滋病检测实验室开展自愿咨询检测工作，给予技术支持和指导。艾滋病检测筛查实验室n 包括艾滋病筛查中心实验室、艾滋病筛查实验室和艾滋病检测点。n 艾滋病筛查中心实验室设在市地级疾病预防控制中心；n 艾滋病筛查实验室和艾滋病检测点可设在疾病预防控制机构、医疗

49、机构、采供血机构、计划生育技术服务机构等。艾滋病筛查实验室职能n 1开展艾滋病病毒抗体的筛查试验，根据需要可开展其他艾滋病检测工作。 2负责将艾滋病病毒抗体筛查呈阳性反响的样品送当地艾滋病筛查中心实验室或艾滋病检测确证实验室。 3定期汇总艾滋病检测资料，并上报当地艾滋病筛查中心实验室或艾滋病检测确证实验室。 4对自愿咨询检测工作提供技术支持。艾滋病检测点职能n 1开展艾滋病病毒抗体的筛查试验。 2负责将艾滋病病毒抗体筛查呈阳性反响的样品送当地艾滋病筛查实验室或艾滋病筛查中心实验室。 3定期汇总艾滋病检测资料，并上报当地艾滋病筛查实验室或艾滋病筛查中心实验室。 4开展艾滋病自愿咨询检测工作。第三

50、章艾滋病检测实验室的验收n 开展艾滋病检测工作的实验室要经过技术和条件验收，未经验收或验收不合格的实验室不得开展艾滋病检测工作。n 设立艾滋病检测实验室的机构或单位应向省级卫生行政部门提交申请书。n 省级卫生行政部门组织专家组按照“艾滋病检测实验室根本标准见附件，对艾滋病检测实验室人员业务能力、设施、条件等进展验收。艾滋病检测确证实验室的验收n 省级卫生行政部门组织专家组对申请材料进展审查，对符合规定、材料齐全的申请者，组织有国家级专家参加的省级艾滋病检测实验室验收专家组进展现场验收。省级卫生行政部门对通过验收者发出合格通知，同时抄送省级疾病预防控制中心，未通过验收者整改后可重新提出申请。艾滋

51、病检测筛查实验室的验收n 省级卫生行政部门组织专家组对申请材料进展审查，对符合规定、材料齐全的申请者，由省级或市地级艾滋病检测实验室验收专家组进展现场验收。省级卫生行政部门对通过验收者发出合格通知，同时抄送省级疾病预防控制中心，未通过验收者整改后可重新提出申请。n 省级卫生行政部门在组织对采供血机构执业验收时，应选派艾滋病检测实验室验收专家组专家参加对采供血机构实验室的验收。采供血机构取得执业许可后，抄送省级疾病预防控制中心备案。n 迁移艾滋病检测实验室或变更艾滋病检测实验室的类别，按本方法上述规定重新申请验收。n 省级卫生行政部门应将艾滋病检测实验室验收情况对外公布，并承受相关部门的监视检查

52、。第四章艾滋病检测工作要求n 艾滋病检测实验室应在规定的职能围开展检测工作，遵守国家法律、法规和有关规。检测技术与程序应符合全国艾滋病检测技术规的要求。n 艾滋病检测实验室技术人员需要经过相关的业务培训，经考核合格者由相关机构发给培训证书，持证上岗。非卫生专业技术人员不得从事艾滋病检测工作。n 艾滋病检测实验室中使用国家规定需要强检的仪器设备，必须由同级或上级计量认证部门定期检定，非国家强检的仪器设备应定期要求厂家或供给部门维护和校准。n 艾滋病检测实验室中使用的检测试剂必须是经国家食品药品监视管理局注册、且符合相关要求的试剂。n 艾滋病检测筛查实验室发现艾滋病病毒抗体筛查呈阳性反响的样品必须

53、与时送艾滋病检测确证实验室，不得擅自处理。n 艾滋病检测确证实验室收到送检样品后应尽快进展确证试验，最迟不得超过十个工作日，一次性检测大量样品等特殊情况除外。n 艾滋病检测确证实验室出具的艾滋病病毒抗体确证报告应以方式发送。艾滋病病毒抗体确证试验结果应当告知本人；本人为无行为能力人或者限制行为能力人的，应当告知其监护人。n 艾滋病检测实验室应有专人负责妥善保存检测记录和各种档案，不得擅自修改和销毁。记录保存期不少于十年，国家法律、法规另有规定的，依照有关规定执行。n 艾滋病检测工作应遵守自愿和知情同意原那么，国家法律、法规另有规定的除外。艾滋病自愿咨询检测需按艾滋病免费自愿咨询检测管理方法试行

54、执行。n 艾滋病检测实验室工作人员不得泄露艾滋病病人或感染者的、住址、检测结果等有关情况。第五章艾滋病检测工作中的生物安全n 艾滋病检测实验室应按照国家有关法律、法规的相关规定，对污染场所、物品以与医疗废弃物进展消毒和无害化处置，遵循“标准防护原那么，防止实验室外污染。n 艾滋病检测工作中涉与到艾滋病病毒毒种株和检测样品的采集、保藏、携带、运输，必须符合卫生部的有关规定。n 艾滋病检测实验室必须执行实验室生物安全通用要求GB 19489-2004的要求与卫生部的有关规定。n 艾滋病检测实验室人员发生职业暴露后，应按照医务人员艾滋病病毒职业暴露防护工作指导原那么试行与其它相关规定与时处理。第六章

55、实验室质量管理n 艾滋病参比实验室负责对全国艾滋病检测实验室的检测质量进展检查。艾滋病确证中心实验室负责对职责围的艾滋病检测实验室的检测质量进展检查。n 艾滋病检测实验室应建立健全实验室质量保证和质量控制体系，并有专人负责质量体系的正常运转。n 艾滋病检测筛查实验室必须参加省级以上实验室能力验证；艾滋病检测确证实验室必须参加中国疾病预防控制中心组织的实验室能力验证。艾滋病检测实验室能力验证结果由组织者定期公开发布。第七章监视管理n 各级卫生行政部门应当加强对艾滋病检测实验室的监视管理工作。实验室未经验收或验收不合格擅自开展艾滋病检测工作的，由本级或上级卫生行政部门责令限期改正，并通报批评。n

56、艾滋病检测实验室有以下情形之一的，由本级或上级卫生行政部门责令限期改正，并依法对其所在的机构、单位和责任人进展查处： 一艾滋病检测筛查实验室出具艾滋病病毒抗体阳性报告与筛查呈阳性反响的样品不按规定送检的； 二使用不符合本方法所规定试剂的； 三在艾滋病检测工作中未开展实验室室质量控制或未参加实验室能力验证的； 四使用非卫生技术人员或未经培训合格的技术人员从事艾滋病检测工作的； 五未按照规定对实验室废弃物、污物进展消毒处理的； 六在艾滋病检测工作中弄虚作假，出具虚假检验报告的； 七擅自修改检测记录或未按规定保存记录，造成严重后果的； 八违反本管理方法所规定其他有关条款的。第八章附那么n 国家质量监

57、视检验检疫总局主管出入境检验检疫机构艾滋病检测与其监视管理工作。n 国家出入境检验检疫机构按照本管理方法规定的标准和规，确定本系统承当出入境人员艾滋病检测工作的实验室，并将实验室验收情况抄送当地卫生行政部门与疾病预防控制机构。n 军队艾滋病检测工作由中国人民解放军卫生主管部门参照本方法实施监视管理。武警部队艾滋病检测工作由武警部队卫生主管部门参照本方法实施监视管理。n 艾滋病检测实验室验收方法和全国艾滋病检测技术规由中国疾病预防控制中心另行制定。n 艾滋病检测：是指采用实验室方法对人体血液、其他体液、组织器官、血液衍生物等进展艾滋病病毒、艾滋病病毒抗体与相关免疫指标检测，包括监测、检验检疫、自

58、愿咨询检测、临床诊断、血液与血液制品筛查工作中的艾滋病检测。 艾滋病检测实验室：是指对人体血液、其他体液、组织器官、血液衍生物等进展艾滋病病毒、艾滋病病毒抗体与相关免役指标检测的所有实验室的统称。 疾病预防控制机构：指从事疾病预防控制活动的疾病预防控制中心以与与上述机构业务活动一样的单位。n 医疗机构：指按照医疗机构管理条例取得医疗机构执业许可证，从事疾病诊断、治疗活动的机构。n 采供血机构：指采集、提供临床用血和生产用原料血浆的机构，包括血液中心、中心血站、中心血库、特殊血液成分库和单采血浆站等。n 出入境检验检疫机构：指负责出入境卫生检疫、动植物检疫与商品检验的行政执法机构，由国家质量监视

59、检验检疫总局与其设立的各地分支机构组成。n 实验室能力验证：利用实验室间的比对确定实验室的检测能力。n 标准防护原那么：是指医务人员将所有病人的血液、其他体液以与被血液、其他体液污染的物品均视为具有传染性的病原物质，医务人员在接触这些物质时，必须采取防护措施。n 本方法实施前已获正式批准的艾滋病检测实验室不再重新验收。n 1997年卫生部发布的全国艾滋病检测工作规同时废止。附：艾滋病检测实验室根本标准n 艾滋病检测筛查实验室n 1、人员条件 至少由3名医技人员组成，其中具有中级卫生技术职称人员至少1名。负责筛查试验的技术人员需具有2年以上从事病毒性疾病血清学检测工作经验，承受过省级以上艾滋病检测