载体系统PPT学习教案

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1、会计学1第第2页页/共共65页页第1页/共65页第第3页页/共共65页页第2页/共65页第第4页页/共共65页页第3页/共65页单链切割单链切割连接单链切割单链切割连接共价闭合环形DNA（scDNA型）开环DNA（ocDNA）线性DNA（cccDNA）环形双链的质粒环形双链的质粒DNADNA分子具有三种不同构型分子具有三种不同构型第第5页页/共共65页页第4页/共65页第第6页页/共共65页页第5页/共65页第第7页页/共共65页页第6页/共65页第第8页页/共共65页页第7页/共65页第第9页页/共共65页页第8页/共65页 转化（transformation）： 是将异源DNA分子引入另一

2、细胞品系， 使受体细胞获得新遗传性状的一种手段。质粒转化细菌常用方法：热激法、电击法 第第10页页/共共65页页第9页/共65页1.2.1 两个概念两个概念克隆载体克隆载体(cloning vector) : 使目的片段能在细菌细胞中复制的载体使目的片段能在细菌细胞中复制的载体;表达载体（表达载体（Expression Vector ）: 使目的基因能在细菌细胞中表达为使目的基因能在细菌细胞中表达为RNA或蛋白或蛋白质的载体。质的载体。第第11页页/共共65页页第10页/共65页（1 1）具有复制起点）具有复制起点（2 2）具有抗菌素抗性基因）具有抗菌素抗性基因（3 3）具有若干限制酶单一识别

3、位点）具有若干限制酶单一识别位点（4 4）具有较小的相对分子质量和较高）具有较小的相对分子质量和较高的拷贝数。的拷贝数。第第12页页/共共65页页第11页/共65页第第13页页/共共65页页第12页/共65页 1.2.4 天然质粒用作载体的局限性天然质粒用作载体的局限性天然质天然质 粒粒 相对分子质量相对分子质量拷贝数拷贝数单一酶切位点单一酶切位点选择性标记选择性标记复制类型复制类型pSC1015.81069.09 kb13EcoR Itetr严紧严紧ColE14.210620EcoR I大肠杆菌素大肠杆菌素松弛松弛RSF21247.410610EcoR I (BamH I)ampr松弛松弛局

4、限性：局限性：分子量高、拷贝数低、合适的单一酶切分子量高、拷贝数低、合适的单一酶切位点少、位点少、选择标记不合适选择标记不合适第第14页页/共共65页页第13页/共65页常用的选择标记：常用的选择标记： 抗氨苄青霉素、抗四环素、抗氯霉素和抗卡那抗氨苄青霉素、抗四环素、抗氯霉素和抗卡那霉素等基因。霉素等基因。选择标记的应用：选择标记的应用： 利用质粒编码的可选择标记产物选择目标菌落。利用质粒编码的可选择标记产物选择目标菌落。第第15页页/共共65页页第14页/共65页第第16页页/共共65页页第15页/共65页pBR322质粒载体的形体图质粒载体的形体图第第17页页/共共65页页第16页/共65

5、页pBR322质粒载体的结构来源质粒载体的结构来源TetrAmprOri第第18页页/共共65页页第17页/共65页pBR322质粒载体的优点：质粒载体的优点： 具有较小的相对分子质量具有较小的相对分子质量(4363bp) 具有两种抗菌素抗性基因可供作具有两种抗菌素抗性基因可供作转化子的选择记号转化子的选择记号(Ampr和和Tetr) 具有较高的拷贝数（具有较高的拷贝数（15个个,松弛型）松弛型）第第19页页/共共65页页第18页/共65页DNA连接酶连接酶pBR322质粒载体质粒载体tetr基因插入失活效应基因插入失活效应第第20页页/共共65页页第19页/共65页第第21页页/共共65页页

6、第20页/共65页pUC18pUC19含四个部分：含四个部分：（1）来自）来自pBR322的质粒的质粒复制起点（复制起点（ori）；）；（2）ampr ; （3）大肠杆菌大肠杆菌半乳糖苷酶半乳糖苷酶基因（基因（lacZ）的启动子及）的启动子及其编码其编码-肽链的肽链的DNA序列；序列；（4）多克隆位点）多克隆位点（MCS）lacZOriAmprMCS第第22页页/共共65页页第21页/共65页 Blue WhiteampramprInsertInsertNo insertLac ZLac Z第第23页页/共共65页页第22页/共65页 具更小的分子质量具更小的分子质量(2.69kb)(2.69

7、kb)和更和更 高的拷贝数高的拷贝数(500 - 700(500 - 700个个) ) 适于组织化学方法检测重组体适于组织化学方法检测重组体 具多克隆位点具多克隆位点MCSMCS区段区段第第24页页/共共65页页第23页/共65页1.5 穿梭质粒载体穿梭质粒载体（shuttle plasmid vector） 是一类由人工构建的具有两种不同复制是一类由人工构建的具有两种不同复制起点和选择记号，因而可在两种不同的寄起点和选择记号，因而可在两种不同的寄主细胞中存活和复制的质粒载体。主细胞中存活和复制的质粒载体。第第25页页/共共65页页第24页/共65页大肠杆菌大肠杆菌- -酿酒酵母酿酒酵母穿梭质

8、粒载体穿梭质粒载体第第26页页/共共65页页第25页/共65页第第27页页/共共65页页第26页/共65页能能在在体体外外转转录录克克隆隆基基因因的的质质粒粒载载体体第第28页页/共共65页页第27页/共65页（1 1）不稳定性类型）不稳定性类型 分离不稳定性分离不稳定性 结构不稳定性结构不稳定性（2 2）影响稳定性主要因素）影响稳定性主要因素 新陈代谢负荷新陈代谢负荷 拷贝数差度拷贝数差度第第29页页/共共65页页第28页/共65页2.1 噬菌体的结构及其核酸类型2.2 噬菌体的生命周期2.3 噬菌体载体2.4 M13噬菌体载体第第30页页/共共65页页第29页/共65页2.1 2.1 噬菌

9、体的结构及其核酸类型噬菌体的结构及其核酸类型 不同种类的噬菌体颗粒，在结构上有很大差别。不同种类的噬菌体颗粒，在结构上有很大差别。 三种不同基本类型：三种不同基本类型： 无尾部的二十面体型无尾部的二十面体型 具尾部的二十面体型（大多数噬菌的构形）具尾部的二十面体型（大多数噬菌的构形） 线状体型线状体型第第31页页/共共65页页第30页/共65页T2噬菌体结构示意图噬菌体结构示意图第第32页页/共共65页页第31页/共65页 第第33页页/共共65页页第32页/共65页2.2 2.2 噬菌体的生命周期噬菌体的生命周期（1 1）溶菌生长周期噬菌体（烈性噬菌体）溶菌生长周期噬菌体（烈性噬菌体）（2

10、2）溶源生长周期噬菌体（温和噬菌体）溶源生长周期噬菌体（温和噬菌体）第第34页页/共共65页页第33页/共65页（1）烈性噬菌体的生活周期）烈性噬菌体的生活周期第第35页页/共共65页页第34页/共65页E.coli T4E.coli T4噬菌体的生命周期（以分钟记）噬菌体的生命周期（以分钟记）第第36页页/共共65页页第35页/共65页裂解循裂解循环环溶源态溶源态（2）温和噬菌体）温和噬菌体的生活周期的生活周期第第37页页/共共65页页第36页/共65页cI OR PR PL OL基因基因早期左向转录早期左向转录早期右向转录早期右向转录基因基因噬菌体的阻遏噬菌体的阻遏-操纵基因系统操纵基因系

11、统CI=阻遏基因；阻遏基因； P=启动子；启动子；O=操纵基因；操纵基因；L=左向；左向；R=右向右向注：注：cI基因和基因和cro基因编码的蛋白质，同两个操纵基因（基因编码的蛋白质，同两个操纵基因（OL， OR）之间的相互作用决定是发生溶菌反应还是溶源反应，如这两个操之间的相互作用决定是发生溶菌反应还是溶源反应，如这两个操纵基因都已摆脱了阻遏状态，则进入溶菌周期。纵基因都已摆脱了阻遏状态，则进入溶菌周期。第第38页页/共共65页页第37页/共65页2.3 2.3 噬菌体载体噬菌体载体第第39页页/共共65页页第38页/共65页2.3.1 噬菌体的分子生物学概述 噬菌体颗粒中的噬菌体颗粒中的D

12、NADNA是一线性双链是一线性双链DNADNA分分子，长子，长48 502bp48 502bp，两端各有，两端各有1212个碱基的个碱基的55凸出黏性末端是互补的。进入细胞的凸出黏性末端是互补的。进入细胞的DNADNA通过两端的黏性末端环化。通过两端的黏性末端环化。 噬菌体上有些基因可被取代而不影响其噬菌体上有些基因可被取代而不影响其生活周期。生活周期。第第40页页/共共65页页第39页/共65页第第41页页/共共65页页第40页/共65页第第42页页/共共65页页第41页/共65页噬菌体噬菌体DNADNA的核酸内切限制酶的限制图（的核酸内切限制酶的限制图（KbKb）第第43页页/共共65页页

13、第42页/共65页第第44页页/共共65页页第43页/共65页第第45页页/共共65页页第44页/共65页第第46页页/共共65页页第45页/共65页第第47页页/共共65页页第46页/共65页第第48页页/共共65页页第47页/共65页第第49页页/共共65页页第48页/共65页注意：噬菌载体作为载体，其重组噬菌体DNA大小只能： 38kb 52kb。体外包装：噬菌载体 + 尾部蛋白 + 头部蛋白 第第50页页/共共65页页第49页/共65页第第51页页/共共65页页第50页/共65页第第52页页/共共65页页第51页/共65页pHC796.4 kb柯斯质粒载体柯斯质粒载体pHC79的形体图

14、的形体图由由pBR322质粒质粒DNA与与噬菌体噬菌体DNA的的cos位点及其控制位点及其控制包装作用的序列构成包装作用的序列构成第第53页页/共共65页页第52页/共65页部分柯斯质粒的基本特性部分柯斯质粒的基本特性第第54页页/共共65页页第53页/共65页（4）具有与同源序列质粒进行重）具有与同源序列质粒进行重组的能力。组的能力。广泛应用于基因组广泛应用于基因组DNA文库的文库的构建。构建。第第55页页/共共65页页第54页/共65页第第56页页/共共65页页第55页/共65页(如如EcoR I)38kb52kb应用柯斯质粒作载体构建基因组文库的一般程序应用柯斯质粒作载体构建基因组文库的

15、一般程序第第57页页/共共65页页第56页/共65页 由质粒载体和单链噬菌体载体结由质粒载体和单链噬菌体载体结合而成的新型载体系列，称为噬菌合而成的新型载体系列，称为噬菌粒（粒（phagemid或或phasmid）第第58页页/共共65页页第57页/共65页噬菌粒噬菌粒质粒质粒单链噬单链噬菌体菌体辅助噬菌体辅助噬菌体 大肠杆菌大肠杆菌寄主菌株寄主菌株pEMBL8pUC8f1IR171/18pRSA101VXM13M13变异株变异株 XS127，XS101pUC118/pUC119pUC18/pUC19M13M13K07MV1184pBSpUCf1M13K07XL-Blue几种常用的噬菌粒载体的

16、一般特征几种常用的噬菌粒载体的一般特征第第59页页/共共65页页第58页/共65页pUC119(MCS)pUC118(MCS)puC118和和pUC119噬菌粒载噬菌粒载体的分子体的分子结构结构第第60页页/共共65页页第59页/共65页（1）无辅助噬菌体时）无辅助噬菌体时pUC118/pUC119的复制的复制亲本亲本pUC质质粒粒（2）有辅助噬菌体时）有辅助噬菌体时pUC118/pUC119的复制的复制M13辅助噬菌体的基因组辅助噬菌体的基因组pUC118/pUC119噬菌粒载体的两种复制模噬菌粒载体的两种复制模型型第第61页页/共共65页页第60页/共65页第第62页页/共共65页页第61

17、页/共65页(8)(8) 可直接对克隆的基因进行核苷可直接对克隆的基因进行核苷酸测序。酸测序。第第63页页/共共65页页第62页/共65页(yeast artificial chromosome, YAC) 真核生物染色体的几个最为重要的部位：真核生物染色体的几个最为重要的部位： 端粒重复序列端粒重复序列（telomeric repeat ， TEL） 着丝粒着丝粒（centromere ， CEN） 自主复制序列自主复制序列（autonomously replication sequences，ARS） YAC 载体的载体的选择标记选择标记主要采用营养缺陷型基因，如色氨酸、亮氨主要采用营养缺陷型基因，如色氨酸、亮氨酸合成缺陷型基因酸合成缺陷型基因 trp 1、 leu 2 YAC本身可小至本身可小至8 kb（如（如pYAC2质粒），克隆能力可质粒），克隆能力可达达1000 kb以上。以上。五 酵母人工染色体载体第第64页页/共共65页页第63页/共65页(bacterial artificial chromosome, BAC)六 细菌人工染色体载体第第65页页/共共65页页第64页/共65页