免疫学：7-3免疫学技术

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1、7.3.1 单克隆抗体技术由来单克隆抗体技术由来1975年，年，Kohler 和和Milstein首次成功地将首次成功地将绵羊红细胞免疫的脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞融绵羊红细胞免疫的脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合，经过筛选合，经过筛选、克隆化培养等制备出小鼠抗克隆化培养等制备出小鼠抗绵羊红细胞单克隆抗体，这一技术的问世在医绵羊红细胞单克隆抗体，这一技术的问世在医学和生命科学领域影响深远，两人获得学和生命科学领域影响深远，两人获得1984年年诺贝尔医学奖。诺贝尔医学奖。7.3.2 单单克隆抗体技术含义克隆抗体技术含义纯化与保存纯化与保存单克隆抗体制备的第一个关键单克隆抗体制备的第一个关键小白鼠的品系：纯

2、合子的小白鼠的品系：纯合子的BALB/C2、小鼠骨髓瘤细胞的准备、小鼠骨髓瘤细胞的准备 与免疫脾细胞小白鼠为同品系与免疫脾细胞小白鼠为同品系 骨髓瘤细胞在分化期骨髓瘤细胞在分化期 小鼠骨髓瘤细胞的特点：小鼠骨髓瘤细胞的特点： 1）稳定，易培养）稳定，易培养 2）自身不分泌免疫球蛋白）自身不分泌免疫球蛋白 3）融合率）融合率 4）为）为HGPRT和和TK缺陷型缺陷型 3、融合、融合 单克隆抗体制备的中心环节单克隆抗体制备的中心环节5、杂交瘤细胞的检测（、杂交瘤细胞的检测（ELISA等等血清学方法筛选阳性克隆血清学方法筛选阳性克隆 包备抗原包备抗原 加入上清加入上清 加入酶标二抗加入酶标二抗 加入

3、底物显色加入底物显色 PBS洗洗PBS洗洗PBS洗洗6、阳性杂交瘤细胞的克隆化培养、阳性杂交瘤细胞的克隆化培养克隆化方法：克隆化方法：7. 单克隆抗体属性的鉴定单克隆抗体属性的鉴定 通过琼脂双向扩散鉴定单克隆抗体属哪一通过琼脂双向扩散鉴定单克隆抗体属哪一亚类亚类(IgG1-4 、IgM1-2 、IgA1-2)和哪一型（和哪一型（型和型和 型）。型）。 8、生产与纯化、生产与纯化生产生产纯化纯化1. 硫酸铵沉淀法硫酸铵沉淀法HAT选择培养基的作用原理：选择培养基的作用原理： 细胞合成细胞合成DNA的途径：的途径： - 主要途径主要途径 - 旁路途径旁路途径 A（氨基喋呤）氨基喋呤），为四氢叶酸的

4、拮抗物，可切断主要，为四氢叶酸的拮抗物，可切断主要途径。途径。 H（次黄嘌呤）次黄嘌呤）、T（胸腺嘧啶核苷）胸腺嘧啶核苷）为第二途径所为第二途径所需要，但要求能利用需要，但要求能利用H和和T的两种酶，即：次黄嘌呤鸟嘌呤的两种酶，即：次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶（磷酸核糖转移酶（HGPRT）和胸腺嘧啶核苷激酶（和胸腺嘧啶核苷激酶（TK）。补救途径补救途径主要途径主要途径次黄嘌呤次黄嘌呤（H）次黄嘌呤鸟嘌呤磷次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶酸核糖转移酶（HGPRT）胸腺嘧啶核苷激酶胸腺嘧啶核苷激酶（TK）核苷酸核苷酸脱氧核苷酸脱氧核苷酸嘌呤嘌呤 嘧啶嘧啶氨基喋呤氨基喋呤 （A）RNADNARNA、DN

5、A生物合成示意图生物合成示意图胸腺嘧啶核苷胸腺嘧啶核苷 （T）1. 1. 用作细胞融合剂的聚乙二醇（用作细胞融合剂的聚乙二醇（PEGPEG）一般选用分一般选用分子量为子量为4 4,000,000，常用浓度为，常用浓度为5050，pH8.0pH8.0pH8.2pH8.2（用用1010NaHCONaHCO3 3调整），分子量小的调整），分子量小的PEGPEG，融合融合效应差，又有毒性，分子量过大，则粘性太大，效应差，又有毒性，分子量过大，则粘性太大，不易操作。不易操作。2. 2. 技术上的误差常常导致融合的失败。例如，供技术上的误差常常导致融合的失败。例如，供者淋巴细胞没有查到免疫应答。者淋巴细胞

6、没有查到免疫应答。3. 3. 融合试验最大的失败原因是污染，融合融合试验最大的失败原因是污染，融合成功的关键是提供一个干净的环境，以成功的关键是提供一个干净的环境，以及适宜的无菌操作技术。及适宜的无菌操作技术。4. 4. 大量繁殖杂交瘤细胞时，如接种到组织大量繁殖杂交瘤细胞时，如接种到组织相容性的同系小鼠或不能排斥杂交瘤的相容性的同系小鼠或不能排斥杂交瘤的小鼠（无胸腺的裸鼠），杂交瘤细胞就小鼠（无胸腺的裸鼠），杂交瘤细胞就开始无限地繁殖，直至宿主死亡。开始无限地繁殖，直至宿主死亡。鼠抗体鼠抗体人人ScFvScFv-毒素毒素FvFabFab-酶酶嵌合抗体嵌合抗体改型抗体改型抗体CD4免疫粘附剂免

7、疫粘附剂鼠鼠VHVL鼠源鼠源人源人源抗原特异性鼠抗体抗原特异性鼠抗体人人 抗抗 体体转染瘤转染瘤人鼠嵌合抗体人鼠嵌合抗体鼠鼠人人鼠鼠人人1. 天然抗体库：天然抗体库：天然抗体库：抗体基因片段来源于未经任何天然抗体库：抗体基因片段来源于未经任何抗原刺激的抗原刺激的B细胞，基本代表了天然抗体的抗体谱。细胞，基本代表了天然抗体的抗体谱。2. 半合成抗体库：半合成抗体库：人们用人工合成的一段简并序列核苷酸取人们用人工合成的一段简并序列核苷酸取代天然抗体库中某一段序列，通常是代天然抗体库中某一段序列，通常是VH CDR3。其特点其特点是库容量大，但由于库中抗体基因没有经过体内免疫系是库容量大，但由于库中

8、抗体基因没有经过体内免疫系统的选择，因此筛选出的抗体的亲和力都不高。统的选择，因此筛选出的抗体的亲和力都不高。 3. 免疫的抗体库：免疫的抗体库：抗体基因来源于经抗原免疫过的供体，其抗体基因来源于经抗原免疫过的供体，其特点是具有较强的抗原特异性和亲和性，多样性不如前特点是具有较强的抗原特异性和亲和性，多样性不如前两种抗体库。两种抗体库。 从杂交瘤细胞从杂交瘤细胞 从脾脏淋巴细胞从脾脏淋巴细胞 ScFv (single chain Fv)的构建的构建 VH VL接头接头DNA (Gly4Ser)3 V H 引 物引 物Over-lap PCR VH 接头接头DNA酶切、克隆酶切、克隆 变性、复性

9、变性、复性V L 引 物引 物VL 噬菌体噬菌体抗体抗体库的构建库的构建 单链抗体单链抗体scFv 噬菌体展示载体噬菌体展示载体pCANTAB5E示意图示意图 The construction scheme of scFv expression vector pCANTAB5EpCANTAB 5E-scFv5243 bpg3 signalsfiIscFvNotIE-tagAmber stopfd gene3M13 oriAp单链抗体单链抗体的的ELISAELISA鉴定和测序鉴定和测序单链抗体单链抗体的表达的表达免疫印迹免疫印迹(immunoblotting)又称蛋白质印迹又称蛋白质印迹 (We

10、stern blot)，是一种借助特异性抗体鉴定抗原的有效方法。该法是是一种借助特异性抗体鉴定抗原的有效方法。该法是在凝胶电泳和固相在凝胶电泳和固相 免疫测定技术基础上发展起来的一种新免疫测定技术基础上发展起来的一种新的免疫生化技术。将含有目标蛋白的免疫生化技术。将含有目标蛋白(抗原抗原)的样品首先用的样品首先用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)或非变性电泳或非变性电泳(Native-PAGE)等分离后，通过电转仪将蛋白原位转印至硝酸纤维素等分离后，通过电转仪将蛋白原位转印至硝酸纤维素膜或其它膜的膜或其它膜的 表面，然后将膜表面的蛋白质再用抗原抗体表面，然后将膜表

11、面的蛋白质再用抗原抗体反应进行特异性检测。反应进行特异性检测。过程：过程：将经将经SDS-PAGE分离的蛋白质带转移到膜上后，分离的蛋白质带转移到膜上后， 膜用封闭液处理，然后与第一抗体反应，膜经漂膜用封闭液处理，然后与第一抗体反应，膜经漂 洗后再与偶有辣根过氧化物酶洗后再与偶有辣根过氧化物酶(HRP)或碱性磷酸或碱性磷酸 、 (酯酯)酶酶(AP)的第二抗体反应，加人生色底物反应之的第二抗体反应，加人生色底物反应之 后，即可显示出目标蛋白的位置。后，即可显示出目标蛋白的位置。特点：特点：由于免疫印迹具有由于免疫印迹具有SDS-PAGE的高分辨力和固相的高分辨力和固相 免疫测定的高特异性和敏感性

12、，其优点是方法简免疫测定的高特异性和敏感性，其优点是方法简 便、标本可长期保存、结果便于比较。便、标本可长期保存、结果便于比较。应用：应用：广泛用于分子生物学等领域，成为免疫学、微生广泛用于分子生物学等领域，成为免疫学、微生 物学及其他生命科学常用的一种研究方法。物学及其他生命科学常用的一种研究方法。 分离胶分离胶转移至硝酸转移至硝酸纤维素膜（印迹）纤维素膜（印迹）免疫反应免疫反应加底物显色加底物显色底物、供氢体（底物、供氢体（H2O2、辣根过氧化物酶辣根过氧化物酶(HRP) 磁性微粒磁性微粒( (magnetic magnetic microspheresmicrospheres, MMS)

13、 , MMS) 是是8080年代初，用高分子材料和金属离子为原料，年代初，用高分子材料和金属离子为原料，聚合而成的一种以金属离子为核心，外层均匀聚合而成的一种以金属离子为核心，外层均匀地包裹高分子聚合体的固相微粒。地包裹高分子聚合体的固相微粒。 在液相中，受外加磁场的吸引作用，在液相中，受外加磁场的吸引作用，MMSMMS可可快速沉降而自行分离，无需进行离心沉淀。因快速沉降而自行分离，无需进行离心沉淀。因此，将此，将MMSMMS应用于免疫检测，可使操作过程大为应用于免疫检测，可使操作过程大为简化。经过特异性抗体包被制成简化。经过特异性抗体包被制成免疫免疫MMSMMS，与检与检样中的抗原结合形成免

14、疫样中的抗原结合形成免疫MMS-MMS-靶分子靶分子( (或靶细胞或靶细胞) )复合体，通过外加磁场的作用即可与其他成分复合体，通过外加磁场的作用即可与其他成分分离开来。再以适当方式使复合体解离，在磁分离开来。再以适当方式使复合体解离，在磁场吸引下除去游离的免疫场吸引下除去游离的免疫MMSMMS，即可获得纯化的即可获得纯化的靶分子或细胞。靶分子或细胞。 磁性微粒分离细胞磁性微粒分离细胞SPRSPR对附着在金属薄膜表面的介质折射率非常敏感对附着在金属薄膜表面的介质折射率非常敏感, ,当表面介当表面介质的属性改变或者附着量改变时，共振角将不同。因此，质的属性改变或者附着量改变时，共振角将不同。因此

15、，SPRSPR谱（共振角的变化谱（共振角的变化vsvs时间）能够反映与金属膜表面接触时间）能够反映与金属膜表面接触的体系的变化。的体系的变化。Science 2002, 295:2103-21051. 抗原抗体之间结合的特异性抗原抗体之间结合的特异性2. 目标分子的浓度目标分子的浓度3. 抗原抗体结合以及解离过程的动抗原抗体结合以及解离过程的动力学参数力学参数4. 结合的强度结合的强度用用SPR可获得的信息可获得的信息SPRvInteractions involving all types of biomolecules such as proteins, lipids, carbohydra

16、tes, and nucleic acids can be studied. v Studies can also be made of reagents ranging in size from small organic molecules, e.g. drug candidates, to large molecular assemblies, such as membrane receptors embedded in lipid bilayer vesicles or even whole cells.SPRvSensor Chip NTA is designed to bind h

17、istidine-tagged molecules. vAttachment of ligands via histidine-tags provides a valuable and convenient methodological interface between BIA analysis and other laboratory techniques that rely on His-tags, e.g. chelating chromatography. vAttachment via a His-tag has also the advantage of orienting th

18、e ligand molecules in a homogeneous way and allowing the attachment to be carried out without significantly changing the pH or ionic strength during the coupling procedure.SPRv Sensor Chip SA is designed to bind biotinylated molecules. v Streptavidin-biotin coupling provides an alternative to other

19、ligand coupling methods e.g. covalent amine or thiol coupling, and is particularly valuable for applications in molecular biology where immobilization of nucleic acids through a 5-biotin moiety is often the most practical approach. 自自LiedbergLiedberg等于等于19831983年首次运用年首次运用SPRSPR技技术进行抗原抗体相互作用分析以来，术进行抗

20、原抗体相互作用分析以来，SPRSPR生生物传感器已广泛应用于基础生命科学、制物传感器已广泛应用于基础生命科学、制药、食品及环境科学等领域。近几年，新药、食品及环境科学等领域。近几年，新的技术理论和方法学的发展又推动了的技术理论和方法学的发展又推动了SPRSPR生生物传感器向小分子的相互作用研究、药物物传感器向小分子的相互作用研究、药物筛选、临床诊断、细胞膜模拟筛选、临床诊断、细胞膜模拟 、蛋白质组、蛋白质组学等新兴的应用领域扩展。学等新兴的应用领域扩展。对生物分子进行识别及定量检测对生物分子进行识别及定量检测研究生物分子间的相互作用研究生物分子间的相互作用Johne, B. et al. (1

21、993) Journal of Immunological Methods 160:191-198.No purificationNo labellingEarlier characterizationKinetic informationBIACOREBIACOREConventionalTimeMethod TimeIsotypingDay 1ELISAOne DayAffinityDay 1 & 2RIAWeeks + labellingKineticsDay 1 & 2NANAEpitope MapOvernight ELISAWeeks + labellingAssayDay 2Va

22、rious EIADays - WeeksExtended mapDay 3ELISAOne day + labellingTOTAL2 - 3 daysWeeks - Months 实验采用约实验采用约2140 2140 RURU的抗原包被的抗原包被CM5CM5芯片的通道芯片的通道1 1，对照通道，对照通道2 2不包被抗原，不包被抗原，纯化的抗体用纯化的抗体用running bufferrunning buffer（10 10 mMmM TrisTris, 150 , 150 mMmM NaClNaCl（pHpH 7.4 7.4）稀释稀释5 5个浓度以个浓度以30 30 L/minL/min

23、流速流过芯片流速流过芯片1 1、2 2通通道。动力学数据采用道。动力学数据采用BIAevaluationBIAevaluation 4.1 4.1软件和软件和1:11:1LangmuirLangmuir结合模型统计。结合模型统计。 SPR方法测定单链抗体亲和力动力学曲线方法测定单链抗体亲和力动力学曲线Sensorgram of the kinetic response of various concentrations of scFv to immobilized rb-PrPc. scFv was injected at concentrations of 0, 9.4, 18.78, 37.5, 75.0, 150.0 nM from bottom to top 思考题思考题一一. 名词解释：单克隆抗体技术名词解释：单克隆抗体技术 基因工程抗体技术基因工程抗体技术 二二: 问答题问答题: 单克隆抗体技术的主要程序有哪些？采用单克隆抗体技术的主要程序有哪些？采用HAT 选择培养基的依据是什么？选择培养基的依据是什么？