基因治疗原理与研究进展

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1、第十三章基因治疗原理与研究进展根据靶细胞不同，基因治疗分为:体细胞（somat i ccel I)基因治疗生殖细胞(germ I ine) 基因治疗。只限于某一体细胞的 基因的改变只限于某个体的当代。对缺陷的生殖细胞进 行矫正。当代及子代基因治疗的概念将某个遗传物质转移到患者细胞内,使其在体内发挥作用，以达到治疗疾病目的的 方法。内容提要1 .基因治疗的策略2 .基因转移技术3 .基因干预4 ,治疗基因的受控表达5 .基因治疗的应用研究6基因治疗的问题与展望第一节基因治疗的策略、基因置换(gene replacement)定义：指将特定的目的基因导入特定细胞, 通过定位重组，导人的正常基因，以

2、置换基 因组内原有的缺陷基因。目的：将缺陷基因的异常序列进行校正。特点：对缺陷基因的缺陷部位进行精确 的原位修复，不涉及基因组的任何改变。I 基因同源重组技术 又称为基因打靶(gene targeting )- 定向整合的条件：转导基因的载体与基 因组DNA具有相同的序列。带有目的基 因的载体就能找到同源重组的位点，进 行部分基因序列交换。二、基因添力口(gene augmentation)定义：通过导入外源基因使靶细胞表达其本身不表达的基因。类型:A.在有缺陷基因的细胞中导入相应正常基因,而细胞内缺陷基因并未除去，通过导入正常基因的表达产物，补偿缺陷基因的功能;.向靶细胞中导入靶细胞本来不表

3、达的基因, 利用其表达产物达到治疗疾病的目的。三、基因干预(gene interference)定义：采用特定的方式抑制某个基因的表 达，或者通过破坏某个基因的结构而使 之不能表达，以达到治疗疾病的目的。例如反义核酸、核酶或干扰RNA技术等。自杀基因治疗恶性肿瘤基因治疗的主要方法之一。原理：将“自杀”基因导入宿主细胞中,这种基因编码的酶能使无毒性的药物前体转化为细胞毒性代谢物，诱导靶细胞产生“自杀”效应，从而达到清除肿瘤细胞的目的。11自杀基因的作用机制（一）自杀基因系统A. TK/GCV : 单纯疱疹病毒（herpssimplex virus, HSV) I 型胸昔激酶(thymidine

4、kinase, tk )基因编码胸昔激酶，特异性地将无毒的核昔类 似物丙氧鸟首（ganciclovir, GCV） 转变成毒性GCV三磷酸核甘，后者能抑 制DNA聚合酶活性，导致细胞死亡。13，（-）自杀基因系统B. CD/5-FC :大肠杆菌胞喀咤脱氨酶（cytos ine deaminase, CD ）基因，在 细胞内将无毒性5-氟胞喀咤（5-FC ）转 变成毒性产物5-氟尿喀唳（5-FU）。& （二）旁观者效应旁观者效应：“自杀基因”导入后，不仅 使导入了 “自杀基因”的肿瘤细胞在用药后 被杀死，而且与其相邻或远处的未转导“自 杀基因”的肿瘤细胞也被杀死。其明显增强了自杀基因的肿瘤杀伤作

5、用。&五、基因免疫治疗通过将抗癌免疫增强的细胞因子或主要 组织相容性复合体（MHC）基因导入肿瘤组 织，以增强肿瘤微环境中的抗癌免疫反应。第二节基因转移技术17因治疗的方式1 .直接体内疗法(in vivo)是指将目的基因直集曼件吆直关的组 织器官，使其进犬箱应防缅胭异进行表 达。2 .间接体内疗法(ex vivo)L，达到治疗的目的。是指在体外将目的基因昼朝细胞，续 篌基茵茬容再看效地表达相应产物，19基因转移(gene transfer)技术：1 .病毒介导的基因转移系统2 .非病毒介导的基因转移系统一、病毒介导的基因转移系统病毒载体介导的基因转移效率较高,因此它也是使用最多的基因治疗载体

6、。据统计，有72%的临床实验计划和71%的 病例使用了病毒载体，其中用得最多的 是逆转录病毒载体。21（一）逆转录病毒（Retrovirus）载体膜蛋白核心蛋白逆转录酶人类免疫缺陷病毒（HIV）+SSRNA病毒颗粒进入细胞细胞膜I 去掉病毒衣壳病毒RNA -逆转录双链cDNA 丁逆转录病毒的生活周期I双链 cDNA I整合入细胞基因组J 转录病毒 RNA翻译、组装逆转录病毒的生活周期n逆转录病毒的生活周期ni25LTRLTR(1)两端各有一长末端重复序列LTR。(2 ) 1呷由U3、R和U5三部分组成。TU3内有增强子和启动子;B. U3和U5两端分别有病毒整合序列(IS);C. 在R内还有p

7、oly (A)加尾信号。W - packaging signal11AAAAAAU3 |r|u5|c gag x po! X 皿 ）1 U3 |r|J5LTRLTR（3 ）病毒有三个结构基因：gag、0。/和6/7迷因（4 ） 5 端LTR下游有一段病毒包装所必需的序列（4） 及剪接供体位点（SD）和剪接受体位点（SA）。272.逆转录病毒介导的基因转移系统逆转录病毒载体保留病毒颗粒的包装信号，而缺失病毒颗粒包装蛋白基因;它可以克隆并表达外源基因,但不能自我包装成有增殖能力的病毒颗粒OLTRther叩eutic geneLTR(2)辅助细胞株它由另一种缺陷型逆转录病毒感染构 建而成。该细胞株能

8、合成包装蛋白，用于逆 转录病毒载体包装。由于缺乏包装信号，本 身不能被包装成病毒颗粒。29Retroviral packaging systemPA317 cellRetroviral vector packaging system. Virus producing cells, VPC3.逆转录病毒载体的特点逆转录病毒结构基因gag、env和pol的缺失不影响其他部分的活性。 包装好的假病毒颗粒易于分离制备。 逆转录病毒携带的遗传物质高效地进入 靶细胞。 前病毒通过LTR高效整合至靶细胞基因 组中，有利于外源基因在靶细胞中的永 久表达。314.逆转录病毒载体的主要缺点随机整合，有插入突变、激

9、活癌基 因的潜在危险；逆转录病毒载体的容量较小，只能 容纳7 kb以下的外源基因。(二)腺病毒(adenovirus, AV)载体(二)腺病毒(adenovirus, AV)载体膜DNA病毒。它通过受体介导的内吞作 用进入细胞内，然后腺病毒基因组转移 至细胞核内，保持在染色体外，不整合 进入宿主细胞基因组中。腺病毒的优点L基因导入效率高；2 .宿主范围广；3 .基因转导与细胞分裂无关；4 .重组腺病毒可通过口服经肠道吸收、或喷雾吸 入或气管内滴注；5 .腺病毒载体容量较大，可插入7.5 kb外源基因。35腺病毒载体缺点L不能整合到靶细胞的基因组DNA中。治疗基因 表达时间相对较短。2 .宿主的

10、免疫反应导致腺病毒载体表达短暂。3 .有两个环节可能产生复制型腺病毒：载体与辅 助细胞或患者体内野生型病毒发生重组。4 .靶向性差。（三）腺病毒相关病毒载体(adenovirus associated virus, AAV)是一单链线状DNA缺陷型病毒。其基因组DNA小于5 kb,无包膜，外形为裸露的20面体颗粒。AAV不能独立复制，只有在辅助病 毒（如腺病毒、单纯疱疹病毒、痘苗病毒）存在时， 才能进行复制和溶细胞性感染，否则只能建立溶源性潜伏感染AAV Virus Particles37ITRCAPITRStructure of AAV Virus Genomic DNAREP:病毒复制基因

11、，CAP:编码衣壳蛋白的基因ITR：反向末端重复序列AAV的待点以潜伏感染为主； AAV可以高效定点整合至人染色体中：可以避免随机整合可能带来的抑癌基因失活和原癌基因激活的潜在危险性，而且外源基因 可以舟续稳定表达。39A A V载体的缺陷:o AAV载体容量小，目前最多只能容:“纳5 kb外源DNA片段；Q 感染效率比逆转录病毒载体低。在40%-80%的成人中存在过感染，可能会引起免疫排斥。常用基因治疗载体整合特点安全性感染细胞克隆容量逆转录病 毒载体随机整合， 效率高可能致病分裂细胞7kb腺病毒载 体不整合， 可能丢失安全性较 高分裂细胞、 非分裂细 胞7.5kb腺相关病 毒载体定点整合安

12、全性较 高分裂细胞、 非分裂细5kb4i非病毒载体介导的基因转移系统（一）脂质体介导的基因转移技术基本原理：利用阳离子脂质体单体 与DNA混合后，可以自动形成包埋外源DNA的脂质体，然后与细胞一起孵育, 即可通过细胞内吞作用将外源DNA （即 目的基因）转移至细胞内，并进行表达。Cationic Lipid ReagentDNA-Cationc lipid complexmammalian cellProtein is produced脂质体介导的基因转移示意图（二）受体介导转移技术将DNA与细胞或组织亲和性的配体偶联, 可使DNA具有靶向性。这种偶联通常通过多 聚阳离子（如多聚赖氨酸）来实现

13、。多聚阳 离子与配体共价连接后，又通过电荷相互作 用与带负电荷的DNA结合，将DNA包围，只留 下配体暴露于表面。这样形成的复合物可被 带有特异性受体的靶细胞吞饮，从而将外源 DNA导入靶细胞。OPolylysino-transferrin oonjugotoOZASpeoific binding to traosforrin receptor45（三）基因直接注射技术不需要进行基因工程的繁琐操作，直接将 裸露DNA注入动物肌肉或某些器官组织内。动物实验:1 .将促进心脏血管生长的基因直接注入实验鼠的 心脏，可使其心脏壁内毛细血管增加30% 40%;2 .将胰岛素基因直接注入鼠骨骼肌细胞，能分

14、泌 糖尿病所缺少的胰岛素；3 .肌内注射凝血因子IX基因，可产生血友病所需 的凝血因子IX。基因直接注射法的优点1 .制备具有调控部件的质粒DNA重组体较容易；2 .排除病毒载体可能潜在的致癌性或其他副作用；3 .导入的基因不需整合即可表达；4 .基因直接注射法可反复使用，而病毒载体则可能 诱导体内免疫应答，致使反复治疗效果下降。第三节基因干预一、反义RNA二、RNA干扰三、核酶一、反义RNA(一)反义RNA与基因表达调控利用反义RNA对体外培养的细胞进行基因 表达调控，通常采用的方法有两种：(1 )体外合成反义RNA,直接作用于培养 细胞，细胞吸收RNA后，发挥作用。(2 )构建一些能转录反义RNA的重组质粒, 将这些质粒转入细胞中，转录出反义RNA而发 挥作用。反义RNA的关键技术问题:,专一性转移问题:反义RNA进入靶细胞前的降解问题