质粒提取定量与酶切鉴定PPT学习教案

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1、会计学1三、质粒酶切三、质粒酶切二、质粒定量二、质粒定量四、酶切产物的琼脂糖电泳检测四、酶切产物的琼脂糖电泳检测最后做最后做第1页/共38页 掌握碱裂解法提取质粒的方法掌握碱裂解法提取质粒的方法 掌握紫外吸收测定掌握紫外吸收测定DNADNA的方法的方法 了解质粒酶切鉴定原理了解质粒酶切鉴定原理 掌握琼脂糖凝胶电泳技术掌握琼脂糖凝胶电泳技术实验目的实验目的第2页/共38页Takara EcoRI 限制性内切酶限制性内切酶Takara Hind III 限制性内切酶限制性内切酶Takara 10 M 酶切缓冲液酶切缓冲液BioWest电泳琼脂糖干粉电泳琼脂糖干粉0.5TBE核酸电泳缓冲液核酸电泳缓

2、冲液EB 核酸荧光染料核酸荧光染料Takara 6 电泳上样缓冲液电泳上样缓冲液第3页/共38页第4页/共38页第5页/共38页一、碱裂解法提取质粒一、碱裂解法提取质粒DNA第6页/共38页碱裂解法碱裂解法；煮沸裂解；煮沸裂解；羟基磷灰石柱层析法羟基磷灰石柱层析法；质粒质粒DNA释放法；释放法；酸酚法等酸酚法等质粒提取方法：质粒提取方法：第7页/共38页 基于染色体基于染色体DNA与质粒与质粒DNA的变性与复性的的变性与复性的 差异而达到分离目的。差异而达到分离目的。染色体染色体DNA：氢键断裂，：氢键断裂，变性变性。质粒质粒DNA：大部分氢键断：大部分氢键断裂，但超螺旋共价闭合环状裂，但超螺

3、旋共价闭合环状的两条互补链不会完全分离。的两条互补链不会完全分离。（不完全变性）（不完全变性）质粒质粒DNA：复性复性，溶于溶液中，溶于溶液中染色体染色体DNA：不能复性不能复性；形成缠连；形成缠连的网状结构。的网状结构。 pH =12.6（碱性）（碱性） NaAc溶液溶液 （pH4.8）pH=中性中性染色体染色体DNA与不稳定的大分子与不稳定的大分子RNA、蛋白质、蛋白质-SDS复合物等一起复合物等一起沉淀下来沉淀下来离心离心第8页/共38页pMD18-T第9页/共38页试剂盒的组成：试剂盒的组成：溶液溶液S1：50 mmol/L葡萄糖葡萄糖10 mmol/LEDTA25 mmol/L Tr

4、is-HCl (pH 8.0)2毫克毫克/毫升溶菌酶毫升溶菌酶裂解液裂解液S2：200 mmol/L NaOH 1% SDS中和液中和液S3：3 mol/L NaAc (pH4.8)溶液溶液第10页/共38页1, 取取1.5ml培养物加入培养物加入Eppendorf管中，室温离心管中，室温离心12000rpm1min，弃上清，将离心管倒置，使液体尽可能流尽。弃上清，将离心管倒置，使液体尽可能流尽。2, 加入加入250l 溶液溶液S1中，旋涡振荡，使细菌沉淀分散，彻底悬浮。中，旋涡振荡，使细菌沉淀分散，彻底悬浮。3, 加入加入250l 裂解液裂解液S2，颠倒，颠倒46次混匀（次混匀（不要剧烈振荡

5、不要剧烈振荡），室温静），室温静置置3min（不超过（不超过5min）。）。4, 加入加入350l 中和液中和液S3，立即温和颠倒，立即温和颠倒68次混匀，至出现白色絮状次混匀，至出现白色絮状沉淀。沉淀。5，室温，室温12000rpm离心离心10min。6, 分次小心取上清液转至吸附柱中（带收集管），每次分次小心取上清液转至吸附柱中（带收集管），每次600l，室温，室温12000rpm离心离心30s，弃滤液，将吸附柱重新放回收集管中。，弃滤液，将吸附柱重新放回收集管中。7, 向吸附柱中加入向吸附柱中加入600l 洗涤液洗涤液W， 12000rpm离心离心30s ，弃滤液。，弃滤液。8, 重复步

6、骤重复步骤7一次。一次。9, 空柱空柱10000rpm离心离心2min。10,取出吸附柱，放入一个干净的离心管中，在吸附膜的中间加取出吸附柱，放入一个干净的离心管中，在吸附膜的中间加50l 56 预热的洗脱液，室温放置预热的洗脱液，室温放置1min，12000rpm离心离心1min，收集，收集洗脱液（即纯化的质粒洗脱液（即纯化的质粒DNA），）， -20保存备用。保存备用。 第11页/共38页1.5mL 菌液菌液12000rpm1 min菌体沉淀菌体沉淀溶液溶液S1250l剧烈震荡剧烈震荡裂解液裂解液S2250l颠倒混匀颠倒混匀4-6次次中和液中和液S3350l温和地温和地颠倒混匀颠倒混匀6-

7、8次次12，000rpm10 min室温静置室温静置35min至出现白色絮状沉淀至出现白色絮状沉淀取取600l上清至吸附柱管上清至吸附柱管12，000rpm30s12，000rpm30s洗涤液洗涤液W600l12，000rpm30s12，000rpm2 min取吸附柱至取吸附柱至另一新另一新EP管管洗脱液洗脱液50l12，000rpm1 min室温静置室温静置1min弃滤液弃滤液空柱空柱收集洗脱液备用收集洗脱液备用洗涤液洗涤液W600l弃滤液弃滤液弃滤液弃滤液第12页/共38页加入洗脱液加入洗脱液加入洗涤液加入洗涤液W第13页/共38页利用核酸在利用核酸在260nm处有紫外吸收的特性处有紫外吸

8、收的特性基本原理基本原理紫外分光光度计紫外分光光度计第14页/共38页操作步骤操作步骤1. 取取5 l提取的质粒提取的质粒DNA，加入，加入95 l蒸馏水蒸馏水2. 混合均匀混合均匀3. 用紫外分光光度计测定用紫外分光光度计测定A260第15页/共38页DNA或或RNA的定量的定量A260=1.0相当于相当于 50g/ml双链双链DNA 40g/ml单链单链DNA（或（或RNA） 20g/ml寡核苷酸寡核苷酸紫外光吸收法紫外光吸收法：第16页/共38页DNA纯品纯品: OD260/OD280 = 1.8RNA纯品纯品: OD260/OD280 = 2.0DNA或或RNA的纯度判定的纯度判定第1

9、7页/共38页质粒质粒 DNA: 3 kb 载体载体: pMD18-T 2.7kb 基因基因: CHD5 1.4 kb第18页/共38页GGATCCCCTAGG第19页/共38页第20页/共38页pMD18-T第21页/共38页反应物反应物 体积（体积（l)10 M 酶切缓冲液酶切缓冲液 2质粒质粒DNA 10Hind III 1EcoR I 1H2O 6在一个洁净的在一个洁净的1.5 ml离心管中混匀下列反应物：离心管中混匀下列反应物： 混合后混合后37 水浴水浴12h质粒质粒DNA的酶切分析操作的酶切分析操作1234第22页/共38页影响酶切反应的因素影响酶切反应的因素底物底物DNA的纯度

10、的纯度反应系统：反应系统：(反应缓冲液反应缓冲液)反应体积：反应体积： 甘油浓度甘油浓度5%保温时间与温度保温时间与温度第23页/共38页四、琼脂糖凝胶电泳四、琼脂糖凝胶电泳第24页/共38页电泳：电泳：带电粒子在电场中泳动的现象带电粒子在电场中泳动的现象影响迁移率的因素？影响迁移率的因素？电场电场样品：样品：大小（分子量大小（分子量）形状（构型）形状（构型）电荷电荷共价闭环超螺旋共价闭环超螺旋DNA线性线性DNA开环的双链环状开环的双链环状DNA质粒质粒DNA三种构型三种构型：共价闭环超螺旋共价闭环超螺旋线性线性开环的双链环状开环的双链环状第25页/共38页琼脂糖（琼脂糖（Agarose ）

11、是一种多聚糖，由半乳糖）是一种多聚糖，由半乳糖及其衍生物构成的中性物质，不带电荷。琼脂糖及其衍生物构成的中性物质，不带电荷。琼脂糖透明无紫外吸收透明无紫外吸收，因此，目前多用琼脂糖为电泳因此，目前多用琼脂糖为电泳支持物进行平板电泳。支持物进行平板电泳。第26页/共38页胶浓度（）胶浓度（）线性线性DNA分子大小分子大小（kb）0.35600.61200.70.8100.90.571.20.461.50.242.00.13本次电泳使用本次电泳使用1.0%琼脂糖凝胶琼脂糖凝胶琼脂糖凝胶浓度与琼脂糖凝胶浓度与DNA分子的有效分离范围分子的有效分离范围第27页/共38页琼脂糖凝胶电泳操作琼脂糖凝胶电泳

12、操作第28页/共38页琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳1. 凝胶准备凝胶准备 称称1g琼脂糖置三角瓶中，加琼脂糖置三角瓶中，加0.5TBE 100ml ； 微波炉加热大约微波炉加热大约2分钟，熔化琼脂糖；分钟，熔化琼脂糖；2. 胶床准备胶床准备 将梳子垂直插入到胶床的小凹槽内，梳齿底端和床面将梳子垂直插入到胶床的小凹槽内，梳齿底端和床面有有1mm的间隙；的间隙； 将胶床放在调整好的水平台上；将胶床放在调整好的水平台上；3. 铺胶：将冷却至铺胶：将冷却至60的凝胶倒入准备好的胶床内，凝胶的凝胶倒入准备好的胶床内，凝胶厚度约厚度约5 mm；4. 室温下静置凝胶固化。将带凝胶的胶床置于电泳槽中，室温下静

13、置凝胶固化。将带凝胶的胶床置于电泳槽中，并使并使样品孔位于电场负极样品孔位于电场负极；第29页/共38页第30页/共38页5. 向电泳槽中加入向电泳槽中加入0.5TBE电泳缓冲液，越过凝胶表面即可；电泳缓冲液，越过凝胶表面即可；6. 轻轻拔出固定在凝胶中的梳子；轻轻拔出固定在凝胶中的梳子；7. 样品准备：向核酸样品中加入约为样品体积样品准备：向核酸样品中加入约为样品体积1/6的上样缓冲的上样缓冲液，用加样器轻轻混匀；液，用加样器轻轻混匀；8. 上样：用加样器吸取样品，轻轻的加入到凝胶的样品孔中，上样：用加样器吸取样品，轻轻的加入到凝胶的样品孔中，加样量为加样量为6 l ；9. 盖上电泳槽，接通

14、电源，开始电泳；盖上电泳槽，接通电源，开始电泳； 10. 电泳条件：电压电泳条件：电压80v；时间；时间2530分钟；分钟；11. 电泳结束后，切断电源，取出凝胶。电泳结束后，切断电源，取出凝胶。12. 电泳结果分析：紫外检测仪直接观察电泳条带电泳结果分析：紫外检测仪直接观察电泳条带 13. 取出凝胶，置于取出凝胶，置于凝胶成像仪凝胶成像仪中观察结果，并拍照记录。中观察结果，并拍照记录。第31页/共38页+-1234每组上每组上2个样品个样品第32页/共38页DNA Marker (ladder) 第33页/共38页组成组成0.5TBE, 0.5-1.4%浓度的胶中浓度的胶中，迁移率迁移率 溴

15、酚蓝溴酚蓝=300bp 二甲苯胺蓝二甲苯胺蓝=4kbp 第34页/共38页 染色染色 溴化乙锭溴化乙锭(EthidiumBromide，EB) :3,8-二氨基二氨基-5-乙基乙基-6苯基菲啶溴盐，能插入苯基菲啶溴盐，能插入DNA分子碱基对之间并与之结合分子碱基对之间并与之结合,在紫外在紫外光照射下呈现红橙荧光光照射下呈现红橙荧光, 优点：优点：染色操作简便，快速染色操作简便，快速；灵敏度高灵敏度高 缺点：缺点：有致癌性有致癌性( (使用时一定要戴手套使用时一定要戴手套) )第35页/共38页第36页/共38页1 2M3 45 6 75000300020001000bpM: DNA Marker DL50001. PCR 产物产物; 2. PCR 产物产物3. 质粒质粒DNA; 4. 质粒质粒 DNA5. 酶切产物酶切产物; 6. 酶切产物酶切产物结果分析结果分析第37页/共38页