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1、实验三 PCR扩增姓名：李宗翰 专业：环境工程 学号：1432999 同组人姓名：刘雪飞一、实验目的复习PCR扩增的原理，熟悉PCR的操作流程。二、实验原理 PCR，即聚合酶链式反应，是一项在体外、短时间内大量扩增特定的DNA片段的分子生物学技术。以单链DNA为模板、4种dNTP为底物，在模板3末端有引物存在的情况下，用酶进行互补链的延伸。多次反复的循环能使微量的模板DNA得到极大程度的扩增。PCR包括三个过程：（1）、变性：目的双链DNA片段在94下解链；（2）、退火：两种寡核苷酸引物在适当温度(5060)下与模板上的目的序列通过氢键配对；（3）、延伸：DNA模板引物结合物在Taq DNA聚
2、合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链。 重复循环变性-退火-延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需24分钟， 2-3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。 三、实验仪器及材料PCR扩增仪，微量移液器（0.12.5L、0.510L、10100L三种），Tip头，0.2ml薄壁管，1.5ml离心管，Taq DNA 聚合酶，dNTP，buffer，引物（341FGC和534r），16S全长DNA样本。四、实验步骤1、用微量移液器分别取194LddH2O、
3、25L Buffe、10L dNTP、5L 341FGC引物、5L 534r引物及12.5L Taq DNA聚合酶于1.5ml离心管中，混合均匀后分装到9个0.2ml薄壁管中，每支管加入24L混合液。2、向第18支薄壁管分别加入1L样品模板，第9支管加入1L无菌水做阴性对照。在薄壁管的盖子上写上组号及样品编号。3、将9支薄壁管放入PCR扩增仪中，设置好扩增条件：94 3min；94 30s；55 30s；72 30s；72 5min；15。循环次数3040。设置好后启动扩增仪，开始扩增。4、将扩增的好的样品按下述步骤进行电泳实验：（1）、取0.2g琼脂糖和20ml 0.5TAE于锥形瓶中，放置
4、微波炉中加热2min左右，至混合液透明，取出室温下冷却。将混合液倒入FR-180E制胶器的槽中，插入孔刷，注意不要有气泡。冷却一段时间，等胶凝固。（2）、取10L Loading Buffer染液，在铺平的塑料手套上均匀分成9份，再取4L PCR产物与染液混匀。将10L移液器调至6-7L，依次吸取上述混合液滴，分别加入到1-9号胶孔中，第10号胶孔中加入4L的DL 2000 TM DNA Maeker。（3）、将胶整个放入装满0.5TAE的电泳槽中，通100V电压。（4）、电泳半小时左右，可明显看出染液移动。将胶至于分析仪器内，在紫外灯照射下，得到电泳图并拍照。五、实验结果与讨论1、此次实验结
5、果是什么？（请附图）所得到的实验结果该如何解释？答：此次实验结果如下图所示。图中，1-8号为待测样品，9号为阴性对照，10号为DNA Marker。从电泳结果可以看出，3-6号样品对应Marker的250bp左右处有明显的亮带，说明3-6号样品的PCR扩张很好。2号样品在250bp处条带较微弱，说明扩增效果不是很好。而1、7、8号样品，在250bp左右基本无亮带，说明扩增实验出错，可能是因为模板没取到或者移液器枪头在加样时未深入液面下加入而引起的。9号为阴性对照，在250bp处无亮带，说明效果良好，实验过程中无环境（ddH2O）污染。2、实验过程中需要注意些什么细节？答：（1）、无菌盒内的离心
6、管和薄壁管应用带枪头的微量移液器挑出，防止污染盒内其他管。（2）、配制反应体系时，由于不同样品除了模板不同，其余试剂的加入量均相同，所以可以先在离心管中配制总体系（除模板DNA外的其他试剂均加好），混匀分装到薄壁管后，再向个管内加模板DNA。这种方法比较节约时间。（3）、上述方法配制总体系时，应考虑取样损失及误差，多配一些（如8个样品，1个阴性对照，可以按10个样品的量配制）。（4）、用微量移液器移取液体时，由于移液量很少，所以每次应将枪头插至管底将液体打出。（5）、PCR仪存在边缘效应，即样品板的周围即角落处受热较差，中间区域受热较好，所以当样品数目不多时，尽量放在样品板中间区域。3、通过这
7、个实验你有什么收获？答：通过PCR扩增实验，我对PCR扩增理论有了更深入的认识，而且学到了配制反应体系时的很多细节。同时，我还学会了PCR扩增仪的参数设置及使用，通过老师的讲解，我还了解了PCR扩增仪的一些特殊模式，如touch down以及分块设置退火温度等。六、思考题1、如果你的研究中要扩增大肠杆菌某个酶的基因，你如何进行相关实验？（提示NCBI有大肠杆菌全基因组序列）答：（1）、现在NCBI数据库中找到大肠杆菌的全基因序列；（2）、从全基因序列中找到需要扩增的那个酶的基因片段；（3）、通过引物设计软件来设计PCR扩增所需的引物；（4）、得到目的基因和引物后，通过常规PCR扩增实验来进行扩
8、增。（5）、扩增后结果可以通过电泳实验进行分析。2、一对引物序列为5-GCACTCCAGTCGACTCTACA-3和5-ACCAGTGTCGACACCGCTCA请计算它们的Tm值及选择合适的退火温度，如果按你算的退火温度做PCR时没有得到相应的产物，你怎么解决？答：对于引物序列5-GCACTCCAGTCGACTCTACA-3，Tm1=4（G+C） 2（A+T）=4*（3+8）+2*（5+4）=62对于引物序列5-ACCAGTGTCGACACCGCTCA，Tm2=4（G+C） 2（A+T）=4*（4+8）+2*（5+3）=64Tm1Tm2，则 退火温度=Tm1-5=62-5=57。如果按照次退火温度没有得到相应的产物，可以做一个退火温度优化实验，即用touch downPCR或分模块设置退火温度，看不同温度下的PCR扩增量，选择扩增最好的作为退火温度。
生物实验3PCR扩增 实验报告
