DNA重组酶切和连接PPT学习教案

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1、会计学1DNA重组酶切和连接重组酶切和连接预实验结果预实验结果载体载体（）（）1 2 3PET BluePET Blue质粒质粒DNADNA的琼脂糖电泳（的琼脂糖电泳（1%1%）Lane1Lane1：sample 1 sample 1 Lane2Lane2：sample 2 sample 2 Lane3Lane3：sample 3 sample 3 一条带一条带第1页/共29页杂带杂带预实验结果预实验结果PET BluePET Blue质粒质粒DNADNA的琼脂糖电泳（的琼脂糖电泳（1%1%）Lane1Lane1：sample 1 sample 1 Lane2Lane2：sample 2 sa

2、mple 2 Lane3Lane3：sample 3 sample 3 两条带两条带三条带三条带DNADNA分子的大小分子的大小琼脂糖浓度琼脂糖浓度DNADNA分子构象分子构象染色剂的量染色剂的量电压电压缓冲液的组成缓冲液的组成缓冲液离子强度缓冲液离子强度等等等等分子克隆上册分子克隆上册, ,第五章第五章一条带一条带 1 2 3第2页/共29页我们的结果我们的结果PET BluePET Blue质粒质粒DNADNA的琼脂糖电泳（的琼脂糖电泳（1%1%）Lane1Lane1：MarkerMarker； Lane2Lane2：sample 1; sample 1; Lane3：sample 2;

3、Lane4：sample 31 215000bp10000bp7500bp5000bp2500bp1000bp250bp3 4第3页/共29页我们的结果我们的结果质优量少，成功率低质优量少，成功率低质优量足质优量足卫星菌落？卫星菌落？第4页/共29页我们的结果我们的结果?电泳行为异常电泳行为异常?第5页/共29页我们的结果我们的结果可用可用电泳：尽量减少上样时间，减少扩散；电泳：尽量减少上样时间，减少扩散； 样品尽量均匀分布于胶孔中；样品尽量均匀分布于胶孔中； 尽量远离边缘泳道尽量远离边缘泳道第6页/共29页第7页/共29页第8页/共29页第9页/共29页剪切剪切5NNGOH pGATCCNN

4、33NNCCTAGp HOGNN5 BamHHind+第10页/共29页引物引物1 1 5GTCGCGGATCCGATGTCACGGCCGAGAC 3 CDS CDS 5AGCTGTCATAAAGATGTCACGGCCGAGACTTATAGTCGCT . AKP CDS . . .CDSCDS .CATGAAAGCCGCTCTGGGGCTGAAATAAAACCGCGCCCGG3引物引物2 2 3GAGACCCCGACTTTATTTCGAACAGCG 5BamH1HindpETBlue-2 ATG GCG ATA TCC CGG GAG CTC GTG GAT CCG AAT引物引物1 1： 5

5、GTCGCGGATCCGATGTCACGGCCGAGAC3 BamH 引物引物2 2： 5GCGACAAGCTTTATTTCAGCCCCAGAGC3 Hind第11页/共29页Mg2+ ATP T4DNA连接酶连接酶连接连接第12页/共29页pETBlue-2 3.653kb酶酶 切切连连 接接酶酶 切切pETBlue - AKP(5.2kb)pETBlue-2 3.653kb转化转化复苏复苏 pETBlue-AKP AKPpETBlue-pETBlueAKPAKP第13页/共29页u 酶切：酶切：37370 0C C，水浴酶切，水浴酶切3 3小时小时( (封口膜封口）封口膜封口）u 酶切产物

6、的纯化和盒回收：酶切产物的纯化和盒回收： 直接进行液体回收：直接进行液体回收： 每每100uL100uL溶液加入溶液加入500uL500uL溶胶液，其余的操作步骤同前。溶胶液，其余的操作步骤同前。 向柱子的向柱子的正中央正中央 共共加加20uL20uL洗脱洗脱bufferbuffer，其余步骤同前其余步骤同前。酶酶 切切 反反 应应 体体 系系管号管号核酸核酸10 xbufferK10 xbufferKddHddH2 2O OBamHIBamHIHandIIIHandIIItube1tube1目的基因目的基因 AKP AKP 24 uL24 uL3 uL3 uL0 uL0 uL2 uL2 uL

7、1 uL1 uLtube2tube2pETBlue-2 pETBlue-2 10 uL10 uL 2 uL2 uL5 uL5 uL2 uL2 uL1 uL1 uL实验操作酶切实验操作酶切每人做一至两份每人做一至两份第14页/共29页胶回收原理胶回收原理硅基质材料：硅基质材料：小片段双链小片段双链DNADNA高盐环境与其吸附高盐环境与其吸附 低盐环境与其解离低盐环境与其解离第15页/共29页避免乙醇对避免乙醇对酶促反应的酶促反应的影响影响第16页/共29页1%1%琼脂糖凝胶琼脂糖凝胶 25mL (25mL (用用1xTAE1xTAE配配) 1uL GoldView) 1uL GoldView样品

8、：酶切样品：酶切DNA 4uL + 0.5uL 10 xloadingDNA 4uL + 0.5uL 10 xloading质粒对照：未酶切质粒质粒对照：未酶切质粒DNA 2uL DNA 2uL + 0.5uL 10 xloading0.5uL 10 xloading分子量分子量MarkerMarker： 5uL5uL8080伏恒压电泳，结果凝胶成像分析伏恒压电泳，结果凝胶成像分析注意：注意：MarkerMarker上上5uL5uL时大概的量是时大概的量是50ng/50ng/条带条带上样上样精准精准1)1) 上样顺序（对照）上样顺序（对照）实验操作酶切电泳分析实验操作酶切电泳分析P V0 V1

9、 V1 M第17页/共29页连连 接接 反反 应应 体体 系（系（ 20 uL 20 uL ）目的基因目的基因AKPAKP载体载体pETBlue-2pETBlue-210 x Ligase 10 x Ligase bufferbufferddHddH2 2O OT T4 4DNADNA连接酶连接酶X X uL uLY Y uLuL2 uL2 uLZ Z uL uL2 uL2 uLu 控制载体和目的基因的比例为控制载体和目的基因的比例为1 1：3 31:101:10u 14 140 0C C连接过夜连接过夜u 明天早晨明天早晨？点各组派代表收样品点各组派代表收样品u 20200 0C C保存，用

10、于转化受体细胞保存，用于转化受体细胞实验操作连接实验操作连接第18页/共29页连接产物转化克隆菌株连接产物转化克隆菌株下次实验的简介与准备下次实验的简介与准备第19页/共29页mol/Lmol/L的的CaClCaCl2 2 100mL 100mL两组，两组，高压灭菌高压灭菌2. LB2. LB液体培养基液体培养基 90mL/90mL/组，组，高压灭菌高压灭菌 胰蛋白胨（胰蛋白胨（typtonetyptone 酵母提取物（酵母提取物（ NaCl NaCl 先加先加90mL90mL水溶解后，水溶解后， 5mol/L NaOH5mol/L NaOH调调pHpH值（值（1818LL）分装：分装：250

11、250mLmL锥形瓶，锥形瓶，40mL40mL2 2瓶；瓶； 15mL15mL大试管大试管, 5mL, 5mL2 2管。管。试剂配制试剂配制第20页/共29页1. 1. 试剂试剂2. 2. 小指管：小指管： 1.5 mL 501.5 mL 50个个 3. 3. 枪头：枪头： 5 mL 85 mL 8支支4. 50 mL4. 50 mL离心管：离心管： 4 4个个5. 5. 直径直径9cm9cm的平皿：的平皿： 8 8套套6. 6. 其它枪头：各其它枪头：各1 1盒盒灭菌灭菌第21页/共29页1. X-gal1. X-gal2. 2. 互补互补 3. 3. 感受态细胞制备感受态细胞制备4. No

12、vaBlue4. NovaBlue菌株菌株5. Tuner(DE2)placI5. Tuner(DE2)placI菌株菌株预习预习第22页/共29页第23页/共29页NovaBlueNovaBlue：来源于大肠杆菌来源于大肠杆菌K12K12基因型基因型 endAendA1 1 hsdRhsdR17 (r17 (rK K- -m mK K+ +) ) supEsupE44 44 thithi-1 -1 gyrAgyrA96 96 relArelA1 1 lac recAlac recA1/F1/FproAproA+ +B B+ + lacIlacIq qZM15 ZM15 TnTn10 10 (

13、 (T Tetetr r)第24页/共29页endendA A：该基因表达非特异性核酸内切酶该基因表达非特异性核酸内切酶，它使所，它使所有的有的DNADNA双链解开。双链解开。endAendA基因的突变将使插入的外基因的突变将使插入的外源源DNADNA更加稳定，提取的质粒纯度更高。更加稳定，提取的质粒纯度更高。hsdRhsdR：该基因表达该基因表达型限制酶，对外源的各种型限制酶，对外源的各种DNADNA有严格的限制。有严格的限制。hsdRhsdR基因的变异导致菌株细胞内的基因的变异导致菌株细胞内的型限制酶活性缺失，这对外源基因的导入及质粒型限制酶活性缺失，这对外源基因的导入及质粒的转化是有利的

14、。的转化是有利的。第25页/共29页hsdR17(rk12hsdR17(rk12- -mk12mk12+ +) )：表示表示R17 R17 的变异而导致的变异而导致K K菌菌株来源的株来源的hsdRhsdR的功能丧失。的功能丧失。recA1recA1： recArecA为基因重组相关的基因，表达为基因重组相关的基因，表达ATPATP依依赖型赖型DNADNA重组酶。该基因突变（重组酶。该基因突变（recA1recA1）导致同源）导致同源或异源或异源DNADNA重组不能进行，保持插入重组不能进行，保持插入DNADNA的稳定性的稳定性，对，对DNADNA的转化是有利的。的转化是有利的。supE44

15、(Suppressor) supE44 (Suppressor) ： 该基因表达的阻遏蛋白该基因表达的阻遏蛋白与终止密码子与终止密码子UAGUAG结合，使蛋白质合成终止。结合，使蛋白质合成终止。第26页/共29页Thi-1Thi-1： 该基因表达与硫氨素合成有关的蛋白和酶，该基因表达与硫氨素合成有关的蛋白和酶，thi thi 的变异使硫氨素的生物合成不能进行，最小培养的变异使硫氨素的生物合成不能进行，最小培养基中必须添加硫氨素（基中必须添加硫氨素（VB1VB1），细胞才能正常生长。），细胞才能正常生长。 gyrA96(Gyrase):gyrA96(Gyrase): gyrA gyrA基因表达基

16、因表达DNADNA促旋酶促旋酶A A亚基。亚基。relA1relA1：是松弛调节基因，对是松弛调节基因，对RNARNA的合成具有调节抑制的合成具有调节抑制机制。机制。relArelA基因的突变对目的基因的转录有利。基因的突变对目的基因的转录有利。proABproAB：表达谷氨酸合成有关的酶。表达谷氨酸合成有关的酶。第27页/共29页lacIlacIq q： laclac操纵子的调节基因，编码阻遏蛋白。操纵子的调节基因，编码阻遏蛋白。LacLac基因发生变异而使其大量地表达阻遏蛋白，从基因发生变异而使其大量地表达阻遏蛋白，从而使而使laclac操纵基因几乎完全被抑制。操纵基因几乎完全被抑制。lacZlacZM15M15： lacZ lacZ 的的M15M15是表达是表达半乳糖苷酶半乳糖苷酶片端的一段基因，当片端的一段基因，当M15M15缺失（缺失（M15M15）时）时lacZlacZ基因基因只能表达只能表达片端，片端，半乳糖苷酶没有活性。半乳糖苷酶没有活性。Tn10Tn10（Transposon）： Tn10Tn10是载有四环素抗性基是载有四环素抗性基因的转座子。因的转座子。第28页/共29页