脂类细胞化学——苏丹Ⅲ染色法
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1、 山东大学实验报告 2011年 10月 28 日 姓名 程开源 系年级 2010级临床医学八年制 组别 同组者 孙琳 科目 分子细胞生物学 题目 脂类细胞化学苏丹染色法 学号 201000232012 【实验目的】了解脂肪染色的原理、操作步骤及脂类标本制片原理。【实验原理】脂肪是体内储存能量和供给能量的重要物质,根据其性质可以分为中性脂肪、脂肪酸、胆固醇、鞘磷脂等。很多细胞都含有脂肪,游离状态的脂肪呈小滴状悬浮于细胞质内,比较显著的如肝细胞。脂肪小滴可以集合,将细胞质及细胞核挤到一旁,如脂肪细胞。如果组织中脂肪过多,将会影响其正常功能。如脂肪肝。脂肪不溶于水,易溶于浓乙醇、苯、氯仿和乙醚等,因
2、此制作脂类标本一般不用石蜡切片,而用冰冻切片或者铺片法以保存脂类,固定多用甲醛类固定液。其染色方法有脂溶性染料显示法、化学显示法和特异染色法等。脂溶性染料显示法利用苏丹染料中的苏丹III、苏丹IV或者苏丹黑等溶于脂类,而使脂类显色的原理显示脂类,使用时,要注意选择溶剂,要求既要溶解苏丹染料,又不溶掉脂肪。苏丹染料是偶氮染料,它对脂类的显示是一种简单的物理变化。苏丹染料是一种脂溶性染料,易溶于乙醇但更易溶于脂肪,所以当含有脂肪的标本与苏丹染料接触时,苏丹染料即脱离乙醇而溶于该含脂肪结构中而使其显色。脂肪染料一般选用有机溶剂做溶剂,丙酮和乙醇对染料和脂肪都是很好的溶剂,这样可以染色大的脂肪积累块,
3、但是小的脂肪滴会溶解。60%异丙醇当溶剂,可以减轻脂类的溶解。丙二醇或磷酸三乙酯不会溶解脂类物质,但是能溶解染料,是比较理想的溶剂。用这些溶剂配的染料溶液要过滤以去掉沉淀,防止蒸发,因蒸发会引起染料在材料中积累。常用相同溶剂洗掉多余的染料,然后再用水洗,可以防止多余的染料在材料中沉淀。用锇酸固定的脂肪不溶于无水乙醇、二甲苯等类似的液体,可用于石蜡切片,但是脂肪的标本一般不用石蜡切片或火棉胶包埋,而用如下方法:冰冻切片明胶包埋冰冻切片铺片法【实验材料】1. 试剂:苏丹染液:将0.15克苏丹溶解于100ml70%酒精或纯丙酮和70%酒精混合液中(各50ml),充分摇匀,放入冰箱保存,由于苏丹难溶,
4、需每天拿出进行摇匀,几天即可。临用时过滤,所得滤液即为饱和浓度。70%乙醇溶液甲醛钙2. 器具:显微镜,载玻片,盖玻片,胶头滴管,镊子,剪刀3. 材料:小鼠【实验步骤】1. 断头法处死小鼠,置于解剖盘中,剪开腹腔,用镊子提起小肠将盖玻片紧贴于肠系膜,用剪连同盖玻片和其上粘的肠系膜取下,反扣于已滴加甲醛钙的载玻片上,固定20分钟。2. 吸蒸馏水滴入载玻片与盖玻片之间冲洗,用滴管不断吸去液体以去除固定液。3. 用70%乙醇溶液代替蒸馏水重复步骤2的操作,再进行一次冲洗。4. 用苏丹染色30分钟5. 吸去溢出染液,擦净盖玻片表面及周边,用显微镜观察。【实验结果】1目镜10x 物镜40x脂肪细胞是圆球形,内充满橘红色脂类物质。细胞核呈指环状偏靠细胞膜边缘。2.目镜10x 物镜40x脂肪细胞内充满橘黄色物质【实验结果分析与注意事项】1. 在40x镜观察时,单个细胞的染色效果不明显,其中可能是由于所取小鼠的肠系膜过厚,多层细胞堆积在一起。另外,显微镜的质量亦会影响观察的效果。1. 在进行观察之前,应当用吸水纸尽可能地吸取染液后再进行观察,这样只有脂肪细胞呈橘红色,对比较明显。2. 再解剖小鼠取得肠系膜时,由于肠系膜很容易破损,因此在操作过程中,动作要谨慎、小心一些,以免破坏肠系膜。4
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