八章基因诊断GeneDiagnosisPPT学习教案

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1、会计学1八章基因诊断八章基因诊断GeneDiagnosis第1页/共93页第2页/共93页第3页/共93页n RNA诊断第4页/共93页第5页/共93页第6页/共93页第7页/共93页第8页/共93页第9页/共93页第10页/共93页第11页/共93页利用核酸变性和复性理论：（利用核酸变性和复性理论：（1）双链）双链DNA分子在某些理化因素作用下解旋，条件恢复后又可恢复其双螺旋结构；（分子在某些理化因素作用下解旋，条件恢复后又可恢复其双螺旋结构；（2）具有互补碱基序列的异源核酸单链之间同样可按碱基互补配对原则通过氢键结合为双链。）具有互补碱基序列的异源核酸单链之间同样可按碱基互补配对原则通过氢

2、键结合为双链。第12页/共93页滤膜上核酸固化杂 交去除未参与杂交的探针检 测 杂 交 信 号 制备探针核酸片段探 针 标 记加入标记核酸探针第13页/共93页第14页/共93页 不同的探针在应用中有各自的特点,但最重要的是探针的序列选择.而探针序列又是依据待测核酸序列选择的。对致病性微生物应选用其最保守、最特异的序列；对突变基因的检测，应用含有突变位点的序列或待测基因编码的序列。第15页/共93页第16页/共93页NN T T N T T第17页/共93页1 1、Southern blotSouthern blot：用于DNA检测，不但能检测出特异的DNA片段，还能进行定位和测定分子量，可用

3、于基因的限制性内切酶图谱分析、基因突变分析等。2 2、Northern blotNorthern blot：杂交用于RNA检测，能对组织细胞中的总RNA或mRNA进行定性和定量分析。3 3、dot blotdot blot：既可检测DNA也或检测RNA，用于基因组中特定基因及其表达的定性和定量分析。缺点：特异性较低，不能鉴定所分析的基因分子量。4 4、原位杂交、原位杂交：在组织、细胞和染色体水平作核酸定性在组织、细胞和染色体水平作核酸定性和定量分析，并可定位和定量分析，并可定位。第18页/共93页PCR是在试管是在试管内利用内利用DNA聚聚合酶催化的反合酶催化的反应反复进行同应反复进行同一段一

4、段DNA片段片段合成的过程合成的过程（二）（二）PCR技术是基因诊断的一种技术是基因诊断的一种基础基础技术技术第19页/共93页第20页/共93页1 1、直接采用、直接采用PCRPCR技术进行基因诊断技术进行基因诊断 通过通过PCRPCR技术扩增特异性的基因，可以确定病技术扩增特异性的基因，可以确定病原生物基因是否存在或分析疾病相关的体内基因缺原生物基因是否存在或分析疾病相关的体内基因缺失或基因突变失或基因突变 第21页/共93页2 2、采用、采用PCRPCR产物的限制性片段长度多态性分析产物的限制性片段长度多态性分析（PCRPCRRFLPRFLP）基因突变导致的基因碱基组成和顺序发生改变，基

5、因突变导致的基因碱基组成和顺序发生改变，会在基因结构中产生新的限制性内切酶位点或使原有会在基因结构中产生新的限制性内切酶位点或使原有限制性内切酶位点消失。因此，突变基因经相应的限限制性内切酶位点消失。因此，突变基因经相应的限制性内切酶水解后，其电泳条带的数量和大小就会发制性内切酶水解后，其电泳条带的数量和大小就会发生改变，根据这些改变可以判断突变是否存在。即限生改变，根据这些改变可以判断突变是否存在。即限制性片段长度多态性技术。制性片段长度多态性技术。PCRPCRRFLPRFLP就是利用就是利用PCRPCR技术先将包含待测位点的技术先将包含待测位点的DNADNA片段扩增出来，然后用识别该位点的

6、限制性内切酶片段扩增出来，然后用识别该位点的限制性内切酶水解，根据限制性片段数量和长度作出诊断。水解，根据限制性片段数量和长度作出诊断。第22页/共93页3 3、采用、采用PCRPCR结合等位基因特异性寡核苷酸探针杂交技术结合等位基因特异性寡核苷酸探针杂交技术等位基因特异性寡核苷酸探针技术（等位基因特异性寡核苷酸探针技术（ASOASO）原理：原理： 针对已知突变位点的基因，可以分别针对已知突变针对已知突变位点的基因，可以分别针对已知突变位点的序列，设计一对寡核苷酸探针，其中一条为野生位点的序列，设计一对寡核苷酸探针，其中一条为野生型探针，与无突变序列互补，另一个为突变型探针，与型探针，与无突变

7、序列互补，另一个为突变型探针，与突变序列互补。同时设计探针时，突变碱基应位于探针突变序列互补。同时设计探针时，突变碱基应位于探针的中央，这样在严格控制杂交和洗脱条件下，只有完全的中央，这样在严格控制杂交和洗脱条件下，只有完全互补的探针保留下来，形成稳定杂交分子，而中央碱基互补的探针保留下来，形成稳定杂交分子，而中央碱基与靶序列不匹配的探针则被洗脱。与靶序列不匹配的探针则被洗脱。第23页/共93页采用采用PCRPCR结合等位基因特异性寡核苷酸探针杂交技术结合等位基因特异性寡核苷酸探针杂交技术第24页/共93页第25页/共93页4 4、PCRPCR产物的反相点杂交分析技术产物的反相点杂交分析技术

8、此项技术与此项技术与PCR/ASOPCR/ASO技术原理完全相同，只是杂技术原理完全相同，只是杂交时采用的是反相杂交。是将探针固定在膜上成为交时采用的是反相杂交。是将探针固定在膜上成为固定相，用固定相，用PCRPCR产物作为液体相，进行杂交实验。产物作为液体相，进行杂交实验。第26页/共93页5 5、采用、采用PCRPCR产物的单链构象多态性分析进行基因诊断产物的单链构象多态性分析进行基因诊断第27页/共93页第28页/共93页第29页/共93页6 6、采用、采用PCRPCR结合变性梯度凝胶电泳技术结合变性梯度凝胶电泳技术第30页/共93页7 7、甲基化特异性、甲基化特异性PCRPCR技术技术

9、第31页/共93页甲基化特异性甲基化特异性PCRPCR技术（技术（ MS-PCRMS-PCR ）第32页/共93页第33页/共93页8 8、采用、采用PCRPCR技术进行靶核酸的定量分析技术进行靶核酸的定量分析第34页/共93页PCR扩增有限性扩增有限性-平台期及平台平台期及平台 效应（效应（plateau effect） PCR扩增的扩增的平台效应平台效应第35页/共93页梯度（系列）稀释法：梯度（系列）稀释法：在扩增检测待测样本的同时，扩增一系列稀在扩增检测待测样本的同时，扩增一系列稀释的已知标准（通常为质粒释的已知标准（通常为质粒DNADNA）如果在该标准稀释系列范围内，扩增产物如果在该

10、标准稀释系列范围内，扩增产物/ /模板成线性相关，则可推导出同时扩增的待模板成线性相关，则可推导出同时扩增的待测样本中测样本中PCRPCR模板的相对量模板的相对量. .必须在扩增的必须在扩增的指数期指数期进行进行优点：简单，可作粗糙的定量分析。优点：简单，可作粗糙的定量分析。缺 点 ： 不 准 确 ， 影 响 因 素 多 。缺 点 ： 不 准 确 ， 影 响 因 素 多 。第36页/共93页首先将原始模板进行梯度稀释首先将原始模板进行梯度稀释; ;然后对该稀释系列进行然后对该稀释系列进行PCRPCR扩增测定扩增测定; ;最低的阳性样本被认为含有与一已知的标准稀最低的阳性样本被认为含有与一已知的

11、标准稀释系列中最后的阳性样本中相同量的释系列中最后的阳性样本中相同量的PCRPCR模板模板基本依据：基本依据：PCRPCR扩增的有效起始模板分子数为扩增的有效起始模板分子数为10104 410106 6个个第37页/共93页第38页/共93页非竞争性对照基因定量法非竞争性对照基因定量法 该定量法是靶基因与参照基因的同步扩增。即在同样的反应条件下，在一个试管内同步扩增来自同一DNA 的一段靶序列和另一段内标序列(通常是管家基因或它们的mRNA)。通过比较两种序列的扩增产物电泳带的颜色强度对靶基因定量。第39页/共93页 竞争PCR 与前述方法相似，即靶基因与参考标准在同一反应管中共同扩增，但参照

12、标准通常是一段人工合成的模板而不是内源性基因。竞争PCR 必须构建一个内部标准，此标准能与靶基因竞争聚合酶、核苷酸和引物分子，具有相同的引物结合位点，其扩增产物能通过电泳或高效液相色谱(HPLC)等方法区分开来。 将竞争模板作系列稀释后，加入到恒量的样品DNA进行PCR，通过分离和分析竞争模板与样品DNA产量，对样品DNA进行定量分析。竞争性竞争性PCR：第40页/共93页DNA序列测定是最直接、最准确的基因诊断技术序列测定是最直接、最准确的基因诊断技术第41页/共93页例：四色荧光自动测序分析结果例：四色荧光自动测序分析结果第42页/共93页第43页/共93页第44页/共93页 指在固相支持

13、物上原位合成寡核苷酸或者直接将大量探针以显微打印的方式有序地固化于支持物表面，然后与标记的样品杂交，通过对杂交的检测分析，得出样品的遗传信息（基因序列及表达的信息） 由于在制备过程中运用了计算机芯片的制备技术如显微光蚀刻、显微打印等，且常用硅芯片作为固相支持物，所以称为DNA芯片技术第45页/共93页以大量已知序列的寡核苷酸、cDNA或基因片段作探针，检测样品中哪些核酸序列与其互补，然后通过定性、定量分析得出待测样品的基因序列及表达的信息第46页/共93页第二节对不同疾病采用不同基因诊断的策略第二节对不同疾病采用不同基因诊断的策略 人类疾病多种多样，致病原因不同，因此在基人类疾病多种多样，致病

14、原因不同，因此在基因诊断上也有不同途径和策略。因诊断上也有不同途径和策略。 1 1、对致病基因已经找到、发生机制清楚的疾、对致病基因已经找到、发生机制清楚的疾病，可以通过直接检测致病基因进行基因诊断。病，可以通过直接检测致病基因进行基因诊断。 如：病原微生物的感染：病毒、细菌、寄生虫如：病原微生物的感染：病毒、细菌、寄生虫、真菌等，及与疾病有关的机体内源性基因：癌基、真菌等，及与疾病有关的机体内源性基因：癌基因、抑癌基因、病理基因。因、抑癌基因、病理基因。 第47页/共93页2 2、对致病基因还没找到，发生机制也没有完、对致病基因还没找到，发生机制也没有完全清楚，但致病基因已定位于染色体或基因

15、组全清楚，但致病基因已定位于染色体或基因组的特定区域的疾病，可以通过检测致病基因的的特定区域的疾病，可以通过检测致病基因的联锁遗传标记进行基因诊断。联锁遗传标记进行基因诊断。 如：用限制性内切酶位点作为遗传标记，如：用限制性内切酶位点作为遗传标记，利用该遗传标记与相邻的基因在遗传过程中分利用该遗传标记与相邻的基因在遗传过程中分离几率很低，常常一起遗传，形成连锁特点，离几率很低，常常一起遗传，形成连锁特点，建立了染色体基因连锁图，根据基因连锁图，建立了染色体基因连锁图，根据基因连锁图，通过分析连锁基因的遗传标记，可判断致病基通过分析连锁基因的遗传标记，可判断致病基因存在的可能性。因存在的可能性。

16、第二节对不同疾病采用不同基因诊断的策略第二节对不同疾病采用不同基因诊断的策略第48页/共93页3 3、对多因素、多基因疾病，可以通过检测表型、对多因素、多基因疾病，可以通过检测表型克隆基因进行基因诊断。克隆基因进行基因诊断。第二节对不同疾病采用不同基因诊断的策略第二节对不同疾病采用不同基因诊断的策略如高血压、冠心病、肿瘤、精神病、自身免疫性疾病，由于疾病发生的原因复杂，涉及多基因、多因素。因此可采用表型克隆方法来分析诊断。原理：从分析正常和异常基因组采用差异显示等技术找到正常人和疾病患者之间的差异序列，进行克隆。根据克隆的一组基因差异序列制作相应探针，用制备的这一组探针检测相关疾病的方法。第4

17、9页/共93页第二节对不同疾病采用不同基因诊断的策略第二节对不同疾病采用不同基因诊断的策略4 4、对一些因基因表达异常出现的疾病，可通、对一些因基因表达异常出现的疾病，可通过基因表达的定量分析进行基因诊断。过基因表达的定量分析进行基因诊断。 对与基因表达异常出现的疾病，可以在转对与基因表达异常出现的疾病，可以在转录水平上对该基因的表达的录水平上对该基因的表达的mRNAmRNA量进行分析量进行分析，作出诊断。，作出诊断。第50页/共93页第三节第三节 基因诊断的应用前景基因诊断的应用前景RFLP分析（分析（20世纪世纪80年代年代）2.PCR及其衍生技术及其衍生技术基因诊断的发展历史基因诊断的发

18、展历史第51页/共93页第三节第三节 基因诊断的应用前景基因诊断的应用前景基因诊断过程中存在的问题基因诊断过程中存在的问题第52页/共93页第四节、基因诊断技术检测遗传病第四节、基因诊断技术检测遗传病第53页/共93页基因诊断技术途径：直接分析致病基因分子结构及表达是否异常的直接诊断途径；利用多态性遗传标志与致病基因进行连锁分析的间接诊断途径。第四节第四节 遗传病的基因诊断遗传病的基因诊断第54页/共93页第四节第四节 遗传病的基因诊断遗传病的基因诊断直接诊断：检测已知致病基因直接诊断：检测已知致病基因 必要条件必要条件被检基因的突变类型与疾病发病有直接的因果关系：被检基因的突变类型与疾病发病

19、有直接的因果关系：被检基因的正常分子结构已被确定；被检基因的正常分子结构已被确定；被检基因突变位点固定而且已知。被检基因突变位点固定而且已知。第55页/共93页 1.点突变：（1）导致特异性限制性内切酶位点改变 直接诊断：检测已知致病基因直接诊断：检测已知致病基因第56页/共93页镰状红细胞贫血镰状红细胞贫血HBS-Beta株蛋白基因突变：株蛋白基因突变：第57页/共93页5 3 正常基因正常基因5 3 突变基因突变基因kbkb镰状红细胞贫血患者基因组的限制性酶切分镰状红细胞贫血患者基因组的限制性酶切分析析PCR-RE分析 MstII CCTGAGG-CCTGTGG第58页/共93页kbkbk

20、b正常人正常人突变携带着突变携带着患者患者镰状红细胞贫血患者基因组的限制性酶切分镰状红细胞贫血患者基因组的限制性酶切分析析第59页/共93页1.点突变：（2）无限制性酶切位点改变 直接诊断：检测已知致病基因直接诊断：检测已知致病基因 PCR-ASO斑点杂交或反向斑点杂交等技术。斑点杂交或反向斑点杂交等技术。PCR-ASO斑点杂交或反向斑点杂交技术可快速、简易地检测已知突变。斑点杂交或反向斑点杂交技术可快速、简易地检测已知突变。 第60页/共93页地中海性贫血基因诊断（PCR-ASO）第61页/共93页第62页/共93页BamHIBamHI 2 2 1 1 2 2 10 kb14 kbprobe

21、第63页/共93页14kb10kb第64页/共93页直接诊断：检测已知致病基因直接诊断：检测已知致病基因 在在DNA序列上有较长一段序列的重新排布。包括序列上有较长一段序列的重新排布。包括大片段（数十个碱基甚至数千个碱基）的丢失、大片段（数十个碱基甚至数千个碱基）的丢失、插入、取代、复制放大和倒位等，这些突变进而插入、取代、复制放大和倒位等，这些突变进而引起更大范围内的染色体结构上的改变从而影响引起更大范围内的染色体结构上的改变从而影响多个基因的功能，即染色体突变或畸变，包括染多个基因的功能，即染色体突变或畸变，包括染色体的易位、缺失或染色三体（如唐氏综合征）色体的易位、缺失或染色三体（如唐氏

22、综合征）等等 2.基因重排缺失 ：核酸分子探针杂交与PCR第65页/共93页 （1）Southern 印迹杂交、斑点杂交、原位杂交印迹杂交、斑点杂交、原位杂交，通过设计一系列相应于缺失区域的核苷酸探针，通过设计一系列相应于缺失区域的核苷酸探针，正常者出现杂交信号，而患者则因缺失这一区，正常者出现杂交信号，而患者则因缺失这一区域，而检测不到杂交信号域，而检测不到杂交信号 （2）多重）多重PCR，1988年年Chamberlain等采用等采用多重多重PCR技术成功地同时扩增了人类杜氏肌营养技术成功地同时扩增了人类杜氏肌营养不良蛋白基因的多个基因座不良蛋白基因的多个基因座 直接诊断：检测已知致病基因

23、直接诊断：检测已知致病基因第66页/共93页杜氏肌营养不良症的基因诊断杜氏肌营养不良症的基因诊断 DMD DMD是一种严重致死性疾病（是一种严重致死性疾病（XRXR），），临床临床症状表现肌肉进行性萎缩和乏力。症状表现肌肉进行性萎缩和乏力。 病因是抗肌萎缩蛋白基因突变所致。病因是抗肌萎缩蛋白基因突变所致。Gene Gene 定位定位Xp21 Xp21 ， Gene 2300kb,79 Gene 2300kb,79 个个Exon Exon ，cDNAcDNA全长全长1397413974bpbp，编码编码3685 3685 AaAa，分子量分子量427427kDkD。 DMD 的最主要遗传缺陷是外

24、显子缺失，约占60%70%。第67页/共93页1. DNA Marker 2. 阳性对照 3. 孕妇 1. DNA Marker 2. 阳性对照 3. 孕妇4. 胎儿 5. 阴性对照 4. 胎儿 5. 阴性对照采用多重采用多重PCR法扩增该基因的多个外显子法扩增该基因的多个外显子第68页/共93页3. 基因表达异常mRNA的相对定量分析mRNA长度分析直接诊断：检测已知致病基因直接诊断：检测已知致病基因第69页/共93页第70页/共93页间接基因诊断间接基因诊断第71页/共93页间接基因诊断间接基因诊断第72页/共93页可以通过RFLP连锁分析进行诊断。第73页/共93页 以以3HVR为探针，

25、与为探针，与PvuII酶切后的家系有关成酶切后的家系有关成员的基因组员的基因组DNA进行进行Southern Blot 基因组基因组DNAPvuII酶酶切切DNA片段片段变变性性转膜转膜探针探针变变性性杂交杂交结果分结果分析析间接基因诊断间接基因诊断第74页/共93页第75页/共93页第76页/共93页第77页/共93页肿瘤的基因诊断肿瘤的基因诊断 肿瘤的发生涉及多个基因、多种因素；发生过程呈多阶段性，其发生发展机制十分复杂，同时不同的肿瘤发生机制也不相同，因此在肿瘤的基因诊断时，无法采用统一的策略。第78页/共93页策略一、通过检测肿瘤染色体异位及融合基因诊断 淋巴造血系统肿瘤中,染色体异位

26、和重排发生较为普遍.临床上出现的炎症性淋巴结肿大与淋巴瘤肿大的鉴定: 在淋巴瘤细胞中，T细胞受体（TCR）基因和IgH基因发生重排，原来相隔数百个碱基的IgH基因和TCR基因的V区和J区基因就会靠近在一起，而炎症增生性细胞内就不会发生基因重排，故通过PCR扩增可以鉴定之。第79页/共93页策略二、通过检测癌基因和抑癌基因诊断肿瘤 癌基因的激活及抑癌基因的失活与肿瘤发生发癌基因的激活及抑癌基因的失活与肿瘤发生发展关系密切。多数肿瘤组织或肿瘤细胞中都检测到展关系密切。多数肿瘤组织或肿瘤细胞中都检测到癌基因与抑癌基因的突变。用基因诊断方法：定量癌基因与抑癌基因的突变。用基因诊断方法：定量PCRPCR

27、、印迹技术、印迹技术、PCR-SSCPPCR-SSCP等检测。等检测。 如如rasras癌基因，其激活的分子机制主要是点突变癌基因，其激活的分子机制主要是点突变，因此可通过，因此可通过PCR-ASOPCR-ASO、PCR-SSCPPCR-SSCP等方法。等方法。 P53P53基因是抑癌基因，在肿瘤组织中其常发生突基因是抑癌基因，在肿瘤组织中其常发生突变而失活。因此可通过变而失活。因此可通过PCR-SSCPPCR-SSCP、DNADNA测序分析等，测序分析等，可检测可检测P53P53基因的突变。基因的突变。第80页/共93页策略三、通过检测肿瘤相关病毒诊断肿瘤鼻咽癌Burkitt淋巴瘤肝癌宫颈癌

28、EB病毒HBV、HCV人类乳头瘤病毒HPV第81页/共93页策略四、检测肿瘤标记物基因或策略四、检测肿瘤标记物基因或mRNAmRNA诊断肿瘤诊断肿瘤 肿瘤标记物是肿瘤组织中产生的与肿瘤发肿瘤标记物是肿瘤组织中产生的与肿瘤发生发展过程相关的物质。如肿瘤抗原、激素、生发展过程相关的物质。如肿瘤抗原、激素、酶等。酶等。因此通过特异的肿瘤标记物基因的检测，可以因此通过特异的肿瘤标记物基因的检测，可以帮助对肿瘤的诊断。帮助对肿瘤的诊断。肝癌肝癌甲胎蛋白（甲胎蛋白（AFP）结肠癌结肠癌癌胚抗原癌胚抗原（CEA）第82页/共93页基因诊断在感染性疾病中应用基因诊断在感染性疾病中应用 定性或定量检测致病微生物的核酸定性或定量检测致病微生物的核酸， 已经用于病毒、细菌和寄生虫感染已经用于病毒、细菌和寄生虫感染 的诊断。的诊断。 动态、定量地检测病原体核酸能动态、定量地检测病原体核酸能对对 疗效判断和病情预后疗效判断和病情预后提供客观的依提供客观的依 据。据。第83页/共93页第84页/共93页第85页/共93页第86页/共93页病毒的常规和实时定量PCR技术。（ on April 10, 2003）第87页/共93页检测方法检测方法第88页/共93页第89页/共93页第90页/共93页另一个实验室对同一样本进行检测。第91页/共93页第92页/共93页