微生物检验技术培训

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1、微生物检验技术培训微生物检验技术培训2第1页/共80页20102010年版年版20152015年版（原修订稿）年版（原修订稿）无菌检查：无菌检查： 应 在 洁 净 度应 在 洁 净 度1000010000级背景下的局部级背景下的局部100100级单向流空气区域内或隔级单向流空气区域内或隔离系统中进行。离系统中进行。无菌检查：无菌检查： 应在洁净度应在洁净度B B级背级背景下的局部景下的局部A A级单向流空气级单向流空气区域内或隔离系统中进行。区域内或隔离系统中进行。3第2页/共80页20102010年版年版20152015年版（原修订稿）年版（原修订稿）微生物限度检查：微生物限度检查： 应在洁

2、净度应在洁净度1000010000级背级背景下的局部景下的局部100100级单向流空级单向流空气区域内进行。气区域内进行。微生物限度检查：微生物限度检查： 应在受控环境下（不应在受控环境下（不低于低于D D级）的局部不低于级）的局部不低于B B级单向流空气区域内进行。级单向流空气区域内进行。4第3页/共80页GMP2010年版对洁净度的规定及确认标准洁净度级别悬浮粒子最大允许数/立方米浮游菌cfu/m3沉降菌（）cfu /4小时(2)表面微生物静态静态动态动态接触接触（）cfu /cfu /碟碟5 5指手指手套套cfu /cfu /手套手套0.50.5m m5.05.0m m(2)(2)0.5

3、0.5m m5.05.0m mA A级级352035202020352035202020 1 11 11 11 1B B级级3520352029293520352000002902900 010105 55 55 5C C级级3520352000002 92 9000035203520000000290290000010010050502525D D级级352035200000002 92 9000000不作规不作规定定不作规不作规定定20020010010050505第4页/共80页药品洁净实验室监测项目及频次（参考） 受控区域受控区域 洁净度级别洁净度级别采样频次采样频次 监测项目监测项目

4、无菌隔离系统无菌隔离系统内部内部每次实验每次实验空气悬浮粒子、浮游菌、沉降菌、表面空气悬浮粒子、浮游菌、沉降菌、表面微生物（手套）微生物（手套）相邻外部相邻外部每月一次每月一次空气悬浮粒子、浮游菌、沉降菌、表面空气悬浮粒子、浮游菌、沉降菌、表面微生物微生物微生物洁净实微生物洁净实验室验室无菌检查（以无菌检查（以A/BA/B级或级或A/CA/C级为例）级为例）每次实验每次实验空气悬浮粒子、浮游菌、沉降菌、表面空气悬浮粒子、浮游菌、沉降菌、表面微生物（手套及操作服）微生物（手套及操作服）微生物限度检查以微生物限度检查以A/CA/C级为例）级为例）每周一次每周一次空气悬浮粒子、浮游菌、沉降菌、表面空

5、气悬浮粒子、浮游菌、沉降菌、表面微生物（手套及操作服）微生物（手套及操作服）C C级级每季度一次每季度一次空气悬浮粒子、浮游菌、沉降菌、表面空气悬浮粒子、浮游菌、沉降菌、表面微生物微生物D D级级每半年一次每半年一次空气悬浮粒子、浮游菌、沉降菌、表面空气悬浮粒子、浮游菌、沉降菌、表面微生物微生物6第5页/共80页7第6页/共80页8第7页/共80页9第8页/共80页10第9页/共80页11第10页/共80页内容2010版2015版培培养养系系统统硫乙醇酸盐流体培养基硫乙醇酸盐流体培养基改良马丁培养基改良马丁培养基选择性培养基选择性培养基0.5%0.5%葡萄糖肉汤培养基葡萄糖肉汤培养基营养肉汤培

6、养基营养肉汤培养基营养琼脂培养基营养琼脂培养基改良马丁琼脂培养基改良马丁琼脂培养基硫乙醇酸盐流体培养基硫乙醇酸盐流体培养基胰酪大豆胨液体培养基胰酪大豆胨液体培养基中和或灭活用中和或灭活用培养基培养基 0.5%0.5%葡萄糖肉汤培养基葡萄糖肉汤培养基胰酪大豆胨琼脂培养基胰酪大豆胨琼脂培养基沙氏葡萄糖肉汤培养基沙氏葡萄糖肉汤培养基沙氏葡萄糖琼脂培养基沙氏葡萄糖琼脂培养基12第11页/共80页13第12页/共80页14第13页/共80页15第14页/共80页金黄色葡萄球菌胰酪大豆胨液体（琼脂）培养基胰酪大豆胨液体（琼脂）培养基【1010版：营养肉汤培养基或营养版：营养肉汤培养基或营养琼脂培养基琼脂培

7、养基 】30353035 18h2418h24h h 铜绿假单胞菌枯草芽孢杆菌生孢梭菌硫乙醇酸盐流体培养基硫乙醇酸盐流体培养基 白色念珠菌沙氏葡萄糖液体（琼脂）培养基沙氏葡萄糖液体（琼脂）培养基 【1010版：改良马丁（琼脂）培养版：改良马丁（琼脂）培养基基 】20252025【1010版：版：2 3 - 2 8 2 3 - 2 8 】24h4824h48h h黑曲霉沙氏葡萄糖琼脂斜面培养基沙氏葡萄糖琼脂斜面培养基或用适宜方法制成孢子悬液或用适宜方法制成孢子悬液 【1010版：改良马丁琼脂斜面培养基版：改良马丁琼脂斜面培养基 】5d7d5d7d上述培养物用pH7.0 无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或

8、 0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含菌数小于100 cfu的菌悬液。16第15页/共80页金黄色葡萄球菌各各2 2支支硫乙醇酸盐流体培养基30303535 3d3d铜绿假单胞菌生孢梭菌空白1 1支支枯草芽孢杆菌各各2 2支支胰酪大豆胨液体培养基【1010版：改良版：改良马丁培养基】马丁培养基】202025 25 5d5d白色念珠菌黑曲霉空白1 1支支结果判定结果判定: :空白对照管应无菌生长，若加菌的培养基管均生长良好，判该培养基的灵敏度检查符合规定。17第16页/共80页查”的规定及下列要求进行操作。对每一试验菌应逐一进行验证。方法适用性试验也可与供试品的无菌检查同时进行 。18第17页/

9、共80页19第18页/共80页20第19页/共80页21第20页/共80页22第21页/共80页23第22页/共80页24第23页/共80页25第24页/共80页26第25页/共80页检查5 结果判断27第26页/共80页判断等。除另有规定外，本法不适用于活菌制剂的检查。本检查法可采用替代的微生物检查法，包括自动检测方法，但必须证明替代方法等效于药典规定的检查方法。28第27页/共80页29第28页/共80页30第29页/共80页31第30页/共80页32第31页/共80页33第32页/共80页34第33页/共80页试验菌株试验菌液的制备金黄色葡萄球菌金黄色葡萄球菌CMCC(B) 26 CMC

10、C(B) 26 003)003)胰酪大豆胨琼脂培养基或胰酪大豆胨液体培养基胰酪大豆胨琼脂培养基或胰酪大豆胨液体培养基【1010版：营养肉汤或营养琼脂培养基】版：营养肉汤或营养琼脂培养基】30303535，18182424小时小时铜绿假单胞菌铜绿假单胞菌CMCCCMCC（B)10 104B)10 104枯草芽孢杆菌枯草芽孢杆菌CMCC(B) 63 501CMCC(B) 63 501白色念珠菌白色念珠菌CMCC(F) 98 001CMCC(F) 98 001沙氏葡萄糖琼脂培养基或沙氏葡萄糖液体培养基，沙氏葡萄糖琼脂培养基或沙氏葡萄糖液体培养基，20202525，2 23 3 天天 【1010版：改

11、良马丁（琼脂）培养基，版：改良马丁（琼脂）培养基，2328 2328 ，2448h2448h】黑曲霉黑曲霉CMCC(F) 98 003CMCC(F) 98 003沙氏葡萄糖琼脂培养基或马铃薯葡萄糖琼脂培养基沙氏葡萄糖琼脂培养基或马铃薯葡萄糖琼脂培养基 ，20202525，5 57 7天天 ，或直接获得丰富孢子，或直接获得丰富孢子【1010版：改良马丁琼脂斜面培养基，版：改良马丁琼脂斜面培养基，2328 2328 ，5757天】天】35第34页/共80页需氧菌总数计数金黄色葡萄球菌金黄色葡萄球菌胰酪大豆胨琼脂培养基或胰酪大豆胨琼脂培养基或胰酪大豆胨液体培养基胰酪大豆胨液体培养基303035 35

12、 不超过不超过3 3天天铜绿假单胞菌铜绿假单胞菌枯草芽孢杆菌枯草芽孢杆菌白色念珠菌胰酪大豆胨琼脂培养基3035 不超过5天黑曲霉霉菌和酵母菌霉菌和酵母菌总数计数总数计数白色念珠菌白色念珠菌沙氏葡萄糖琼脂培养基沙氏葡萄糖琼脂培养基202025 25 不超过不超过5 5天天黑曲霉黑曲霉36第35页/共80页3.23.2计数培养基适用性检查计数培养基适用性检查【1515版】版】每一试验菌株平行制备2 管或2 个平皿；接种量不大于100cfu ；同时，用相应的对照培养基替代被检培养基进行上述试结果判定：结果判定：被检固体培养基上的菌落平均数与对照培养基上的菌落平均数的比值应在0.5-2 范围内，且菌落

13、形态大小应与对照培养基上的菌落一致；被检液体培养基管与对照培养基管比较，试验菌应生长良好。37第36页/共80页3.33.3计数方法适用性试验计数方法适用性试验供试液制备接种和稀释抗菌活性的去除与灭活供试品中微生物的回收平皿法薄膜过滤法最可能数法（MPN 法）结果判断38第37页/共80页39第38页/共80页阴性对照试验l以稀释剂代替供试液进行阴性对照试验，阴性对照试验应无菌生长。如果阴性对照有菌生长，应进行偏差调查。40第39页/共80页41第40页/共80页液。42第41页/共80页43第42页/共80页一步 10倍系列稀释。44第43页/共80页45第44页/共80页46第45页/共8

14、0页47第46页/共80页48第47页/共80页49第48页/共80页50第49页/共80页合规定。51第50页/共80页菌、大肠埃希菌、沙门菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、梭菌、白色念珠菌52第51页/共80页53第52页/共80页54第53页/共80页试验菌株试验菌液的制备金黄色葡萄球菌金黄色葡萄球菌CMCC(B) 26003)胰酪大豆胨琼脂培养基或胰酪大豆胨液体培胰酪大豆胨琼脂培养基或胰酪大豆胨液体培养基养基3035，1824小时小时铜绿假单胞菌铜绿假单胞菌CMCC（B)10 104大肠埃希菌大肠埃希菌CMCC（B）44 102 乙型副伤寒沙门菌乙型副伤寒沙门菌CMCC（B）50 09

15、4 白色念珠菌白色念珠菌CMCC(F) 98 001沙氏葡萄糖琼脂培养基或沙氏葡萄糖液体培沙氏葡萄糖琼脂培养基或沙氏葡萄糖液体培养基，养基，2025，23 天天 生孢梭菌生孢梭菌CMCC（B）64 941 梭菌增菌培养基，厌氧条件下梭菌增菌培养基，厌氧条件下3035，2448 小时或接种于硫乙醇酸盐流体培养基小时或接种于硫乙醇酸盐流体培养基中中3035，1824 小时小时 55第54页/共80页56第55页/共80页57第56页/共80页控制菌检查培养基特性试验菌株耐胆盐革兰氏阴性菌【15版：新增】肠道菌增菌液体培养基促生长能力大肠埃希菌铜绿假单胞菌抑制能力金黄色葡萄球菌紫红胆盐葡萄糖琼脂培养

16、基促生长能力+指示特性大肠埃希菌大肠埃希菌麦康凯液体培养基促生长能力大肠埃希菌抑制能力金黄色葡萄球菌麦康凯琼脂培养基促生长能力+指示特性大肠埃希菌【10版：大肠菌群】乳糖胆盐发酵培养基促生长能力大肠埃希菌抑制能力金黄色葡萄球菌乳糖发酵培养基 促生长能力+指示能力 大肠埃希菌 曙红亚甲蓝琼脂培养基或麦康凯琼脂培养基 促生长能力+指示能力 大肠埃希菌 58第57页/共80页59第58页/共80页60第59页/共80页61第60页/共80页62第61页/共80页63第62页/共80页64第63页/共80页65第64页/共80页66第65页/共80页67第66页/共80页色镜检和适宜的鉴定试验，确认是

17、否为大肠埃希菌。68第67页/共80页69第68页/共80页30351824 量RV 沙门菌增菌液体培养物划线接种于木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂培养基平板上，3035培养1848 小时。l沙门菌在木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂培养基平板上生长良好，菌落为淡红色或无色、透明或半透明、中心有或无黑色。用接种针挑选疑似菌落于三糖铁琼脂培养基高层斜面上进行斜面和高层穿刺接种，培养1824 小时，或采用其它适宜方法进一步鉴定。70第69页/共80页71第70页/共80页72第71页/共80页73第72页/共80页74第73页/共80页75第74页/共80页76第75页/共80页77第76页/共80页78第77页/共80页79第78页/共80页80第79页/共80页