课题5DNA的粗提取与鉴定

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1、【主备人】：苗贤举 【审核人】：宋利刚【课题】：课题5 DNA的粗提取与鉴定【备课时间】：3月10日【复习目标】本课题通过尝试对植物或动物组织中的DNA进行粗提取，了解 DNA的物理化学性质，理解 DNA粗提取以及DNA鉴定的原理。【复习重点与难点】复习重点：DNA的粗提取和鉴定方法。复习难点：DNA的粗提取和鉴定方法。【知识回顾】一、实验原理1、提取DNA勺方法提取生物大分子的基本思路是 。对于DNA的粗提取而言，就是要利用 、等在物理和化学性质方面的差异，提取 DNA，去除其他成分。1）DNA的溶解性思考题1 : DNA在氯化钠溶液中的溶解度有什么特点？对此有什么应用？思考题2 :利用什么

2、原理来将 DNA与蛋白质分离开？2） DNA对酶、高温和洗涤剂的耐受性蛋白酶能水解 ，但是对 没有影响。大多数蛋白质不能忍受 6080C的高温，而DNA在以上才会变性。洗涤剂能够瓦解 ，但对DNA没有影响。3）DNA的鉴定思考题3:依据什么原理来鉴定 DNA在条件下，DNA 遇会被染成 色，因此二苯胺可以作为鉴定DNA的试剂。、实验设计1、 实验材料的选取凡是含有的生物材料都可以考虑，但是使用 的生物组织,成功的可能性更大。在下面的生物材料中选取适合的实验材料：鱼卵、猪肝、菜花（花椰菜）、香蕉、鸡血、哺乳动物的红细胞、猕猴桃、洋葱、豌豆、菠菜、在液 体培养基的大肠杆菌2、破碎细胞，获取含 DN

3、A的滤液1）制备和提取细胞核物质：动物细胞的破碎比较容易，以鸡血细胞为例。在鸡血细胞液中加入一定量的 ，同时用搅拌，得到鸡血细胞液。过滤后收集研磨液；如果实验材料是植物细胞，需要先用 溶解细胞膜。例如，提取洋葱的DNA时，在切碎的洋葱中加入一定的 和，进行充分的搅拌和研磨。过滤后收集研磨液。思考：为什么加入蒸馏水能使鸡血细胞破裂？ 加入洗涤剂和食盐的作用分别是什么 如果研磨不充分，会对实验结果产生怎样的影响？ 此步骤获得的滤液中可能含有哪些细胞成分？2）溶解细胞核的 DNA :向收集的滤液中加入 的溶液，搅拌使 DNA呈溶解状态。3、去除滤液中的杂质方案一的原理是 DNA在不同浓度NaCI溶液

4、中溶解度不同；方案二的原理是蛋白酶分解蛋白质，不 分解DNA ;方案三的原理是蛋白质和 DNA的变性温度不同。思考： 为什么反复地溶解与析出DNA，能够去除杂质？ 方案二与方案三的原理有什么不同？4、DNA的析出与鉴定将处理后的溶液过滤 ，加入与滤液体积 、冷却的 ，静置，溶液中会出现，这就是粗提取的 DNA。用玻璃棒 搅拌，卷起丝状物，并用滤纸吸取上面的水分。取两支20ml的试管，各加入物质的量浓度为 的NaCI溶液5ml，将丝状物放入其中一支试管中，用玻璃棒搅拌，使丝状物溶解。然后，向两支试管中各加入4ml的_。混合均匀后，将试管置于 中加热5min，待试管冷却后，比较两支试管溶液颜色 的

5、变化，看看溶解有 DNA的溶液是否变 。三、实验案例：以鸡血细胞 DNA勺提取和鉴定为例：1 .制备鸡血细胞液：在鸡血中加入质量浓度为0. 1g/mL的柠檬酸钠溶液，离心处理；2 提取鸡血细胞的细胞核物质：向鸡血细胞液中加入蒸馏水，搅拌、过滤；思考1:加入蒸馏水的目的是什么？为什么能达到此目的？3 .溶解细胞核内的 DNA加入2moI/L的氯化钠溶液，搅拌，使DNA呈溶解状态;4 .析出含DNA的黏稠物：加入蒸馏水，用玻璃棒搅拌； 思考题2 :此时加入蒸馏水的目的是什么？5.滤取含DNA的黏稠物：过滤；思考题3 :这次过滤与上次过滤的目的一样吗？为什么？6 .将DNA的黏稠物再溶解：加入 2m

6、oI/L的氯化钠溶液，搅拌，使 DNA呈溶解状态；7 .过滤含有DNA的氯化钠溶液：过滤；思考题4 :这一步骤的目的是什么？思考题5:为什么反复地溶解与析出DNA能够去除杂质？8. 提取含杂质较少的 DNA加入冷却的95%勺酒精，搅拌；思考题6 :这一步骤的目的是什么？思考题7:为什么加入的酒精需要冷却的？9. DNA的鉴定：取两支试管，各加入 0. 015mol/L的氯化钠溶液5mL , 一支加入提取的 DNA，两支各加入4mL的二苯胺试剂。混合均匀后置于沸水中加热。四、操作提示1、 以血液为实验材料时，每100ml血液中需要加入 3g，防止。2、 加入洗涤剂后，动作要、，否则容易产生大量的

7、泡沫，不利于后续步骤地操作。加入酒精和用玻璃棒搅拌时，动作要 ，以免，导致DNA分子不能形成絮状沉淀。3、 二苯胺试剂要 ，否则会影响鉴定的效果。4. DNA的溶解度与NaCI溶液浓度的关系：当NaCl溶液浓度低于 0.14mol/L时，随浓度的升高， DNA的溶解度降低；当 NaCl溶液浓度高于 0.14mol/L时，随浓度升高，DNA的溶解度升高。5盛放鸡血细胞液的容器，最好是塑料容器。鸡血细胞破碎以后释放出的DNA容易被玻璃容器吸附，由于细胞内DNA的含量本来就比较少，再被玻璃容器吸附去一部分，提取到的DNA就会更少。因此，实验过程中最好使用塑料的烧杯和试管，这样可以减少提取过程的 DN

8、A的损失。典例解析本实验中有三次过滤：过滤用蒸馏水稀释过的鸡血细胞液过滤含粘稠物的0.14mol/LNaCI溶液过滤溶解有 DNA 的2mol/LNaCI溶液以上三次过滤分别为了获得（）A含核物质的滤液、纱布上的粘稠物、含DNA的滤液B含核物质的滤液、滤液中DNA粘稠物、含DNA的滤液C含核物质的滤液、滤液中DNA粘稠物、纱布上的 DNAD含较纯的DNA滤液、纱布上的粘稠物、含 DNA的滤液答案：A解析:用蒸馏水稀释鸡血细胞液，使血细胞的细胞膜、核膜破裂，释放出核物质，此时过滤只能得到含DNA和其他物质如蛋白质的滤液，这种滤液必须经过实验中其他步骤得相继处理，方能得到较纯的DNA。 DNA在0

9、.13moI/LNaCI溶液中溶解度最低，成丝状粘稠物，可经过滤留在纱布上。【习题巩固】 一、选择题（10个）1.在研究DNA的基因样本前，采集来的血样需要蛋白水解酶处理，然后用有机溶剂除去蛋白质。用蛋白水解酶处理血样的目的是（）A. 除去血浆中的蛋白质B.除去染色体上的蛋白质C.除去血细胞表面的蛋白质D.除去血细胞中的所有的蛋白质，使DNA释放，便于进一步提纯2 .与析出DNA粘稠物有关的叙述，不正确的是（）A. 操作时缓缓滴加蒸馏水，降低DNA的溶解度B. 在操作A时，用玻璃棒轻缓搅拌，以保证DNA分子完整C. 加蒸馏水可同时降低 DNA和蛋白质的溶解度，两者均可析出D. 当丝状粘稠物不再

10、增加时，此时NaCI的浓度相当于0.14mol/L3 洗涤剂能够瓦解（），但对DNA没有影响。A.细胞壁 B.细胞膜 C.细胞核 D. 细胞质4 .在沸水浴的条件下，DNA遇（）会被染成蓝色。A.斐林试剂B.苏丹川染液 C.双缩脲试剂D.二苯胺5在DNA提取过程中，最好使用塑料试管和烧杯，目的是（）A.不易破碎B.减少提取过程中 DNA的损失C.增加DNA的含量 D.容易洗刷6 .下列操作中，对 DNA的提取量影响最小的是（）A. 使鸡血细胞在蒸馏水中充分破裂，放出DNA等核物质B. 搅拌时，要使用玻璃棒沿一个方向轻缓搅拌C. 在“析出DNA粘稠物”时，要缓缓加蒸馏水，直至溶液中粘稠物不再增加

11、D. 在用酒精沉淀 DNA时，要使用冷酒精，甚至再将混合液放入冰箱中冷却E在DNA的溶解和再溶解时，要充分搅拌7. DNA的粗提取中，将与滤液体积相等的、冷却的（）,静置23min,溶液中会出现白色丝状物。A.0 . 9%勺的NaCl溶液C.质量分数15%勺HCl D.体积分数为95%勺酒精溶液8. 以血液为实验材料时，需要向血液中加入（）,防止血液凝固。A.醋酸钠 B.龙胆紫 C.柠檬酸钠D.醋酸洋红9. 在向溶解DNA的 NaCl溶液中，不断加入蒸馏水的目的是（）A.加快溶解DNA的速度 B.加快溶解杂质的速度C.减少DNA的溶解度，加快DNA析出D.减小杂质的溶解度，加快杂质的析出10.

12、 去除滤液中的杂质时，直接在滤液中加入嫩肉粉，利用嫩肉粉中的（）分解蛋白质。A.胃蛋白酶 B.胰蛋白酶 C.木瓜蛋白酶 D.肠肽酶二、非选择题（3个）1提取鸡血中DNA寸，要除去血液中的上清液，这是因为什么？2 填写本实验完成下列实验操作时所用试剂。提取鸡血细胞中核物质 溶解核内 DNA 析出2mol/LNaCl溶液中的 DN DNA粘稠物的再溶解提取杂质较少的 DNA白色乳状丝状物DNA的鉴定3.关于DNA粗提取的实验材料的选择，也经过了多次实验效果的比较，最终选择鸡血做实验材料的原因 是什么？请回答下列问题：鸡血细胞中红细胞 ，家鸡属于鸟类，新陈代谢旺盛，因而血液中 细胞树木较多，可以提供

13、丰富的。实验前由老师制备血细胞液供同学们做实验材料，而不用鸡全血，主要原因是 生活在牧区的人们，采集牛、羊和马血比较方便，若他们按实验要求完成实验步骤后，结果是 这是因为这些动物和人一样，成熟的红细胞中 ，但若改用动物肝脏做实验材料，实验能顺利进行。这是因为 。若选用动物肝脏做实验材料，在提取之前，最好增加 程序，使组织细胞更易分离。【疑难点拨】1.为什么加入蒸馏水能使鸡血细胞破裂?答：蒸馏水对于鸡血细胞来说是一种低渗液体，水分可以大量进入血细胞内，使血细胞胀裂，再加上搅 拌的机械作用，就加速了鸡血细胞的破裂（细胞膜和核膜的破裂），从而释放出DNA。2 加入洗涤剂和食盐的作用分别是什么？答：洗

14、涤剂是一些离子去污剂，能溶解细胞膜，有利于DNA的释放；食盐的主要成分是NaCI，有利于DNA的溶解。3 如果研磨不充分，会对实验结果产生怎样的影响？答：研磨不充分会使细胞核内的DNA释放不完全，提取的 DNA量变少，影响实验结果，导致看不到丝状沉淀物、用二苯胺鉴定不显示蓝色等。4 此步骤获得的滤液中可能含有哪些细胞成分？答：可能含有核蛋白、多糖和5. 为什么反复地溶解与析出 答：用高盐浓度的溶液溶解RNA等杂质。DNA，能够去除杂质？DNA ,能除去在高盐中不能溶解的杂质；用低盐浓度使溶解在低盐溶液中的杂质。因此，通过反复溶解与析出 质。6 .方案二与方案三的原理有什么不同？答：方案二是利用

15、蛋白酶分解杂质蛋白，从而使提取的 白质对高温耐受性的不同，从而使蛋白质变性，与7. DNA的溶解度与NaCI溶液浓度的关系：当NaCI溶液浓度低于0.14mol/L时，随浓度的升高时，随浓度升高，DNA的溶解度升高。8. 制备鸡血细胞液时，要在新鲜的鸡血中加入柠檬酸钠的原因 制备鸡血细胞液时，要在新鲜的鸡血中加入抗凝剂柠檬酸钠,DNA析出，能除去DNA，就能够除去与 DNA溶解度不同的多种杂DNA与蛋白质分开；方案三利用的是DNA和蛋DNA分离。DNA的溶解度降低；当NaCI溶液浓度高于0.14mol/L防止血液凝固。其原理是柠檬酸钠能与血浆中Ca2+发生反应，生成柠檬酸钙络合物，血浆中游离的

16、Ca2+大大减少，血液便不会凝固，因为鸡血红细胞，白细胞都有细胞核，DNA主要存在于细胞核中，所以在离心或静置沉淀后，要弃出上层清液血浆。9 .提取DNA的第一步是材料的选取， 其目的是一定要选取 DNA含量较高的生物材料， 否则会由于实验 过程中或多或少的损失而造成检测的困难；第二步是DNA的释放和溶解，这一步是实验成功与否的关键，要尽可能使细胞内的 DNA全部溶解；第三步是DNA的纯化，即根据DNA的溶解特性、对酶及高温的耐 受性的不同等特性，最大限度地将DNA与杂质分开；最后一步是对 DNA进行鉴定，这是对整个实验的结果的检测。10 .在DNA的析出的步骤中用到玻璃棒搅拌时，注意动作要轻

17、缓，以免加剧DNA分子的断裂，导致DNA分子不能形成絮状沉淀。11 .盛放鸡血细胞液的容器， 最好是塑料容器。 鸡血细胞破碎以后释放出的 DNA ,容易被玻璃容器吸附，由于细胞内DNA的含量本来就比较少，再被玻璃容器吸附去一部分，提取到的DNA就会更少。因此，实验过程中最好使用塑料的烧杯和试管，这样可以减少提取过程的DNA的损失。思考题5、加速了鸡血细胞的破裂（细胞膜和核膜的破裂），从而释放出DNA蒸馏水对于鸡血细胞来说是 一种低渗液体，水分可以大量进入血细胞内，使血细胞胀裂。思考题6、使氯化钠溶液浓度接近 0. 14moI/L，使DNA最大限度地析出。思考题7、不一样；这次过滤是为了去除不溶

18、于氯化钠溶液的杂质，而上次过滤是为了去除破裂的细胞膜等物质。思考题&除去含有DNA滤液中的杂质；思考题9、用高盐浓度的溶液溶解 DNA能除去在高盐中不能溶解的杂质；用低盐浓度使DNA析出，能除去溶解在低盐溶液中的杂质。因此，通过反复溶解与析出DNA就能够除去与 DNA溶解度不同 的多种杂质。思考题10、去除溶于酒精的杂质；思考题11、可抑制核酸水解酶的活性，防止降解DNA降低分子的运动，易于形成沉淀析出；低温有利于增加DNA分子柔韧性，减少断裂。思考题12、确定二苯胺不与氯化钠发生颜色反应；实验组试管中可看到溶液变蓝色。课题5 答案DCBDB BDCCC1答案：因为上清液是血浆，不含有血细胞，DNA存在于沉郁试管底部的鸡血细胞的细胞核中，所以提取鸡血中的DNA时，要除去血液中的上清液。2答案：蒸馏水2mol/LNaCI溶液蒸馏水2mol/LNaCI溶液冷却的95%的酒精二苯胺3.答案：含细胞核；红； DNA 鸡血细胞液中 DNA相对含量很难提取到 DNA ;无细胞核；肝细 胞有细胞核研磨