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1、会计学1Westernblot实验介绍及流程实验介绍及流程第一页，编辑于星期日：六点 二十八分。第1页/共17页第二页，编辑于星期日：六点 二十八分。 电泳槽 玻璃板、梳子、加样校准架等电转移槽 切胶板、黑白夹板、海绵垫等电泳仪 用途：用于生物学实验中对特定目的蛋白质的分离，定性及定量的检测分析，是Western-blot（蛋白免疫印迹）实验中非常重要的部分。 第2页/共17页第三页，编辑于星期日：六点 二十八分。Western blot 实验原理抗原一抗生物素标记的二抗ECL发光试剂第3页/共17页第四页，编辑于星期日：六点 二十八分。提取总蛋白蛋白浓度测定SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳ECL检
2、测封闭二抗一抗洗涤洗涤扫描分析转膜第4页/共17页第五页，编辑于星期日：六点 二十八分。第5页/共17页第六页，编辑于星期日：六点 二十八分。1 A protein sample is subjected to electrophoresis on an SDS-polyacrylamide gel. Western blot 实验流程第6页/共17页第七页，编辑于星期日：六点 二十八分。第7页/共17页第八页，编辑于星期日：六点 二十八分。第8页/共17页第九页，编辑于星期日：六点 二十八分。Western blot 实验流程第9页/共17页第十页，编辑于星期日：六点 二十八分。第10页/共
3、17页第十一页，编辑于星期日：六点 二十八分。4 An antibody that is specific for the protein of interest (the primary antibody - Ab1) is added to the nitrocellulose sheet and reacts with the antigen. Only the band containing the protein of interest binds the antibody, forming a layer of antibody molecules Western blot 实验流
4、程3 The blot is incubated with a generic protein (such as milk proteins or BSA) which binds to any remaining sticky places on the nitrocellulose. 第11页/共17页第十二页，编辑于星期日：六点 二十八分。5 Following several rinses for removal of non-specifically bound Ab1, the Ab1-antigen complex on the nitrocellulose sheet is i
5、ncubated with a second antibody (Ab2), which specifically recognizes the Fc domain of the primary antibody and binds it. Ab2 is radioactively labeled, or is covalently linked to a reporter enzyme, which allows to visualize the protein-Ab1-Ab2 complex .Western blot 实验流程 第12页/共17页第十三页，编辑于星期日：六点 二十八分。W
6、estern blot 实验流程6 ECL detection ECL Kit is based on the enzyme-linked immunodetection of antigen-specific antibody using anti-IgG secondary antibodies conjugated to horseradish peroxidase ( HRP ), which reacts with a chemiluminescent substrate in the presence of a chemical enhancer. 第13页/共17页第十四页，编辑于星期日：六点 二十八分。Western blot 实验结果与分析 c-fosactin62kD42kD将X-光片在凝胶图像分析仪上进行灰度扫描，比较目的蛋白与内参照蛋白的灰度值，可得到蛋白表达半定量分析结果第14页/共17页第十五页，编辑于星期日：六点 二十八分。第15页/共17页第十六页，编辑于星期日：六点 二十八分。第16页/共17页第十七页，编辑于星期日：六点 二十八分。
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