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1、脂肪干细胞成脂诱导及鉴定程序、试剂准备一）成脂分化诱导液（AdipogenicMedium,AM）配方【1】：1.0L(SH30021.01B,Hyclone)试剂名称浓度商品信息极限必须培养基(DulbeccoSModifiedEagleMedium，DMEM)2.胎牛血清(FetalBovineSerum，FBS)3.青霉素/链霉素(Penicillin/Streptomycin)4.地塞米松(Dexamethasone,DM)5.胰岛素(Insulin,IS)6.3-异丁基-1-甲基(Isobutylmethylxanthine,IBMX)7.吲哚美辛(Indomethacin,ID)1
2、0%1%1pmo/L10mol/L黄嘌呤0.5mmol/L200mol/L(ES-009-B,Millipore)(TMS-AB2C,CHEMICON)分子量：392.46(D4902-25MG,Sigma)分子量：5808(91077C1g,Sigma)分子量：222.24(I5879-100MG,Sigma)分子量：357.79(I73785G,Sigma)二）成脂分化诱导液浓储液配制试剂名称f=p曰.质量浓缩倍数配制方法1.StockA分装1ml/管X100胎牛血清1ml/管1X(liquid)保存：-20C2.StockB分装0.1ml/管X100青霉素/链霉素0.1ml/管100X(
3、liquid)保存：-20C3.StockC溶于30ml无水乙醇（0.1%）地塞米松0.0117738g1000X分装0.1ml/管X300保存：-20C4.StockD溶于10mlHcl(0.1mol/L，PH2.0)胰岛素0.05808g100X分装0.1ml/管X100保存：4C5.StockE溶于2.5mlDMSO(0.5%)3-异丁基-1-甲基黄嘌呤0.05556g200X分装0.05ml/EP管X50保存：-20C6.StockF溶于2ml无水乙醇（0.2%）吲哚美辛0.07155g500X分装0.02ml/管X100保存：-20C（三）成脂分化诱导液工作液配制（10ml）1. 取
4、DMEM（L）8.72ml加入15ml离心管（BD）2. 加1管StockA（1ml）；3. 加1管StockB（0.1ml）；4. 取1管StockC（0.1ml）溶解，加入0.01ml;5. 加1管StockE（0.05ml）；6. 加1管StockF（0.02ml）;7. 加1管StockD（0.1ml）;8. 测渗透压，调pH7.2-7.4;9. 0.22m微孔过滤，4C贮存，一周内使用。（四）StromalMedium配制（10ml）121:1. 取DMEM8.9m加入15ml离心管（BD）;2. 力口入1管StockA（1ml）;3. 力口入1管StockB（0.1ml）;4. 调
5、pH7.2-7.4;5. 0.22m微孔过滤，4C贮存，一周内使用。（五）0.5%油红一0配制131油红一O|.5g溶于100ml无水乙醇（50%），分装备用，使用前0.22卩m过滤（六）4%多聚甲醛液配制试剂名称质量/体积甲醛4gPBS100ml调,0.22微孔过滤后使用。二、方法（一）细胞诱导培养1. 间充质干细胞传代培养至第三代，待细胞融合至80%左右，从培养箱内取出细胞至垂直超净台；2. X、Y轴方向摇动培养皿，3次/方向；3. 1ml微量移液器吸弃培养液；4. 加入预温PBS,1ml/孔；5. X、Y轴方向摇动培养皿，3次/方向；6. 吸弃PBS；7. 重复步骤（4）（6），漂洗细胞
6、，2次；8. 加入Trypsin/EDTA消化液，1ml/孔，5min,37C；9. 加入等量StromalMedium，终止消化；10. 1ml微量移液器彻底吹洗皿底，收集细胞悬液至15ml离心管内；11. 1400rpm,RT,5min;12. 小心取出离心管，吸弃上清；13. 加入StromalMedium重悬消化下来的细胞；按1X104个/ml接种到24孔板内（此时若解冻细胞，按冻存密度5*105个/ml计算，可铺6孔板10个孔，12孔板25个孔，24孔板50个孔），加入StromalMedium培养基培养3天，设置对照组（一直使用StromalMedium培养），空白组（添加DMEM
7、覆盖皿底即可）；14. 3天后，实验组吸弃原有培养基，换用成脂诱导培养基（AM）；15. 每2-3天换液一次；16. 诱导2周后，初始脂肪形成时用油红一O染色进行评估。（二）油红一O染色：1. 从培养箱内取出细胞至普通实验台；2. X、Y轴方向摇动培养皿，3次/方向；3. 1ml微量移液器吸弃培养液；4. 加入预温PBS,1ml/孔，；5. X、Y轴方向摇动培养皿，3次/方向；6. 吸弃PBS;7. 重复步骤（4）（6）,漂洗细胞，2次；加入4%多聚甲醛液（覆盖所有细胞即可）固定1h，室温（或4C过夜），蒸馏水洗涤3次；8. 用0.5%的油红一O染色1h（覆盖所有细胞即可），室温；9. 放入7
8、0%的乙醇中分化至间质清晰，然后再用蒸馏水洗涤3次；10. 苏木素染液复染（覆盖所有细胞即可），1-2min，蒸馏水洗涤3次【5】；11. 染色的细胞可以用肉眼在相差显微镜下进行观察确认（为避免皿内干燥影响观察，可留少许液体，且观察时间不宜超过15min或用甘油封盖后可长时间保存）。三、结果脂肪呈鲜红色，细胞核呈蓝色，间质无色。小鼠脂肪组织来源的脂肪干细胞（经成脂诱导2周后）脂肪细胞油红0染色（X200）【6】【1115】ZukPA,ZhuM,MizunoH,HuangJ,FutrellJW,KatzAJ,BenhaimP,LorenzHP,HedrickMH.Multilineagecell
9、sfromhumanadiposetissue:implicationsforCell-Basedtherapies,TissueEng.2001,7(2):211-228.】【4】YuG,WuX,KilroyG,HalvorsenYD,GimbleJM,FloydZE.Isolationofmurineadipose-derivedstemcells.MethodsMolBiol.2011;702:29-36.【】田玉旺，李琳，李丽，胡海.介绍一种改良的油红O脂肪染色法，中国组织化学与细胞化学杂志，2007,16（6）.【6】LuF,GaoJH,OgawaR,MizuroH,HykusokuH.Adiposetissuesdifferentiatedbyadipose-derivedstemcellsharvestedfromtransgenicmice.ChinJTraumatol.2006Dec;9(6):359-64.
脂肪干细胞成脂诱导及鉴定程序
