氨基酸总量的测定

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1、氨基酸总量的测定（茚三酮比色法）一、方法原理：氨基酸的游离氨基与水合茚三酮作用后，可产生二酮茚一二酮茚胺的取代盐等蓝紫色化合物，其颜色深浅与氨基酸含量成正比，据此可以比色测定氨基酸含量。二、试剂：1%茚三酮溶液：茚三酮溶于热水中，加入氯化亚锡；，搅拌溶解，滤去残渣，滹液放在冷暗处过夜，用水定容为，保存声冷暗处。如茚三酮有微红色，配成的溶液也带红色，将影响比色测定，需将茚三酮重结晶后再用方法是：取茚三酮溶于热水中，加入活性炭，轻轻摇动，放三十分钟后过滤，滤液置冰箱中过夜，次日过滤，用冷水淋洗结晶，然后放在干燥器中干燥，装瓶保存。2磷酸盐缓冲液： /磷酸二氢钾溶液：取溶于水中。 /磷酸氢二钠溶液：

2、取磷酸氢二钠溶于水，加水至0取与混匀即得。3%醋酸：取冰醋酸加水至。4氨基酸标准溶液：称取干燥的氨基酸白氨酸，或其它的氨基酸溶解于水，定容为。三、仪器：水浴，分光光度计。四、操作步骤：（一）标准曲线绘制：分别吸取氨基酸标准溶液各置于容量瓶中加水补充至0各加入缓冲液，加入茚三酮，摇匀。置沸水浴中加热分钟，取出迅速冷却至室温，一用水定容。放置分钟，在波长下测定，绘制标准曲线。氨基酸浓度分别为，。二样品测定：提取样品：称取植物样品新鲜样或干样，加醋酸，在研钵中研碎，用水洗移入容量瓶，水定容，过滤到三角瓶中，取滤液测定。.样品液测定：移取样品待测液毫升，放人容量瓶中，加水至，加缓冲液，加茚三酮，摇匀。

3、置沸水浴中加热分钟，取出用冷水迅速冷却至室温，加水定容。放置分钟后，测定。同时测定待测液空白值，扣除空白值后，从标准曲线上查得氨基酸的浓度。五、结果计算：氨基酸总量（，%，）=（pp，*l00*25*100）/（W*V式中：由标准曲线查得样品测定液氨基酸浓度;称样品重吸取样品待测液体积六。注意事项：1配制茚三酮溶液的茚三酮和都应该用五色晶体，配成的溶液一般应在天内用完。2应控制反应溶液的才能得到重现性好的结果，反应液在之间为宜，所加试液和缓冲液的量的比例可为：或1。3要控制加热温度和时间，温度过高容易褪色，温度低发色不全。沸水浴中加热发色快，但可能受热不均匀及容易褪色，可以降低温度，延长加热时间，使发色均匀。也可以在烘箱中加热，烘分钟。4茚三酮与氨萋酸反应生成的颜色在1小时内稳定，浓度高时褪色较快，应在发色稳定、加水定容后，在半小时内比色。5明显带色的试样，可以用活性炭脱色，但某些氨基酸（酪氨酸等）也被活性炭吸附，会使结果降低。6茚三酮与氨、胺类、氨基糖类、尿素、蛋白质等也发生反应，这些物质会干扰测定。7植物样品处理方法不同，游离氨基酸组成会有变化，应用分析结果时应说明样品处理