美国病理学会对于二代测序临床诊断的实验室标准详

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1、 .美国病理学会（CAP）对于二代测序临床诊断的实验室标准相对于桑格测序来说，二代测序的较高的通量和每个碱基所消耗较低的成本，使得其快速应用于临床检测领域。尽管在1988年美国病理学会（CAP）没有给出这项技术在临床诊断上的实验室标准规。但在过去的几年，能够提供二代测序检测服务的实验室相应的不断增加。目的：针对应用二代测序技术的临床诊断给出一个检查清单用以标准化实验操作平台和生物信息数据分析平台。因为基于NGS的临床检测是一个新的诊断技术，而且相对于一代测序其更为复杂，所以目前亟需针对这些检测制定新的标准规。设计：针对NGS制定必要的规章制度，促进这项技术更好地应用于临床检测。在2011年CA

2、P成立了NGS工作组委员会，以对检测清单的项目容进行仔细研究。结果：在CAP分子病理学检测清单中总共包含针对实验操作平台和生物信息数据分析平台的18项实验室认证要求清单。结论：这项经CAP委员会认真考虑后所给的报告述了对于制定新的检测清单的重要性。其中包含文件、批准、质保、验证、异常日志、监控升级、各个版本解释与报告、附带的发现、数据储藏、可追溯性模板、数据传送性等的处理。DNA测序即二代测序技术（NGS）由七十年代的化学测序法和桑格测序法逐渐演化而来。NGS与一代测序主要的不同是其可以并行的对数以百万的DNA短片段同时测序而非仅有一种DNA片段。在九十年代中期基于荧光毛细管凝胶电泳的自动化桑

3、格测序的产生使得DNA测序普遍应用于临床诊断。而NGS更高的通量远远超过自动化桑格测序。二代测序的较高的通量和每个碱基所消耗较低的成本，使得其快速应用于临床检测领域，尽管NGS各方面分析都更为复杂。包括数据获得和储藏的案例远超出于1988年临床检验科改善后的实验室修正案，对于后续数据计算具有较大挑战性。NGS检测的领域涉与遗传病、实体瘤、恶性血液病、传染性疾病，人类白细胞抗原分析，非侵害性产前诊断，胎儿染色体异常检测。但在过去的几年，能够提供二代测序检测服务的实验室相应的不断增加。尽管在1988年美国病理学会（CAP）没有给出这项技术在临床诊断上的实验室标准规。为应对这种需求，CAP成立了NG

4、S工作组委员会，以在这项技术发展初期制定第一套临床检验标准。考虑到基于NGS的测序技术是在原有技术上对仪器、测序反应试剂、生物信息分析等的改进，工作组致力于制定一套用于规NGS临床检测的工作框架管理标准以更好地采纳基于NGS的检测技术。二代测序技术由两部分组成，实验操作平台和生物信息分析平台。实验操作平台一般包含所有的以下流程：病人样品采集处理，核酸提取，片段化，分子标签，外显子组或基因组靶序列富集，接头连接，扩增，文库准备，上样，序列读出。序列是通过对数以百万的DNA片段的读取全自动化的产生。化学实验反应后便是大规模的计算和生物信息分析。通过各种的算法将测到的短的序列去比对匹配人类参考基因组

5、序列。经过图谱比对后，与参考基因组不同的核苷酸变异被识别出来。另一个独立进程是去逐一的或组合的根据其相应的临床表现去分析与临床相关的变异类型。对于个别病人案例，已经被确认的变异参考其正常基因功能受损的注释容进行评估，如早产转录因子、截断蛋白、非同义突变对蛋白功能的影响或剪接位点的改变。为了对疾病和有害突变的关系做出明智的决定，需要根据病人的临床症状结合基因组研究成果。作图比对、变异识别、变异注释以与一定程度上的临床解释包含了生物信息分析的全部工作框架。CAP NGS工作组考虑到化学实验反应平台与生物信息分析平台是相分离的，所以制定的标准也是分开的。一部分实验室利用国外的设备去进行一部分的二代测

6、序检测。一个实验室提供从实验操作平台到生物信息分析，他们临床检测的验证可以整合起来。在CAP分子病理学检测清单中总共包含针对实验操作平台和生物信息数据分析平台的18项实验室认证要求清单。NGS检测项目清单包括对于流程文件建立、批准、质保、验证、异常日志、监控升级、各个版本解释与报告、附带的发现、数据储藏、版本可追溯性、数据传送性等的处理。如同这份报告中描述一样，工作组的目标就是为NGS检测服务提供最初的基本鉴定合格需求。可以预见的就是只要基础的检测验证规需求到位后，随后便会有附加的其它专门规程。这些在注释部分对其进行进一步解决。这项经CAP委员会认真考虑后所给的报告述了对于制定新的检测清单的重

7、要性。另外，这份报告可以作为CAP NGS检测清单的补充，因此容上与2014年检测清单需求紧密相连。NGS实验标准操作流程文件实验室需要建立一个标准操作流程文件。一个详实的标准操作流程文件是临床实验室质量评价的主要部分。所有的DNA/RNA样品准备、片段化、文库准备、分子标签、样品混合、合成测序相关实验操作必须建立标准操作流程文件，这样才能对每一步与随后的操作进行追踪。这包含所有的方法、试剂、仪器、仪器软件、之前的版本等。另外，对于质控标准也需要进行描述。一些案例在后面重点提出。NGS靶序列实验（例如多基因模块或外显子测序）可以在测序前对感兴趣的基因区域进行捕获，关于捕获区域的详细信息以与富集

8、步骤都应以文件的形式进行详细描述。对于处理不同类型样品的临床实验室，如血液、石蜡包埋的福尔马林固定的样本，都应该针对不同样品制定相应的SOPs。用于将病人样本合并的反应试剂和规程必须详细说明，并且其中应包含测序接头信息。用于对运行好坏的评价的质控参数的权衡也需要文件化。常用的度量如目标区域Reads数的比例，质量符合规定的碱基比例，覆盖度的阈值，平均测序深度。实验室必须明文规定好样品制备和测序的接收或拒收标准。最重要的是明确和总结不能够进行分析的区域（如测序深度不充分）。NGS实验操作平台验证实验室对NGS实验平台进行验证，当有所修改变动时，要对整个流程再次进行验证，确保流程中每一部分的表现符

9、合要求。如在分子诊断领域或临床实验室的其他领域，所有的实验室研发的测试，对NGS程序性能分析必须在部进行验证后才可应用于临床。二代测序实验平台包含很多步骤，非常复杂。每一步骤应分别根据经验综合决定最正确条件和参数设置。这些东西设置好后，必须进行从开始到完毕的全部测试的性能验证，包括实验平台和生物信息分析平台。在验证期间需要确定的重要性能有分析的敏感性、特异性、准确度（接近真实值的程度），精确度（重复性和可靠性），检测极限。对于任何分子实验，针对不同的样品类型（血液、唾液、组织），必须独立的进行效验。二代测序检测是旨在对于基因组的多个大的区段进行详细查看。因此，NGS允许检测到新的，以与已知的序

10、列变异。因为无法证实所有的理论上可能的变异，所以必须将methods-based（其它检测方法）和analyte-specific（特定分析物）相结合，作为验证方法来判定检测的性能。通过对已发表的与NGS平台准确性相关的文章的咨询，将有利于对自己实验室验证性工作的认知。在大多数情况下，考虑到桑格测序是金标准，可以通过其确定变异位点。然而，在一些情况下变异位点验证信息也可以通过寡核苷酸微阵列基因分型数据获得。针对于NGS检测，多个专业机构已经发布了关于分子检测验证的指南以供读者参考。NGS工作组对于验证性需求中的最小样品数进行了广泛深刻的讨论。对于不断发展的NGS技术以与在诊断实验室多种多样的应

11、用，这种讨论为时过早。而且存在的问题是设定最小样品数对于NGS诊断来说可能会导致其验证不足。工作组同时也注意到对于已经报道的文章里NGS的验证的样品数量有明显不同（20-80），这说明，individual laboratories are on a validation learning curve.。对于NGS验证需要运行的样品总数量主要取决于检测的区域大小（从技术特性上来说较大的检测区域将会检测到更多的变异位点）。根据特异变异位点的数量进行评估，根据可能的要求，通过等位基因频率围，去判定检测的限度，根据样品运行次数和数量去设定其精确度。出于统计方面考虑，NGS工作组总结到关于样品数量不能

12、全面或普遍的应用于二代测序的众多实验中（如扩增子相对于靶序列捕获，较少基因量相对于外显子组和全基因组，遗传疾病相对于肿瘤相对于传染病）。因此我们给出多个脚本（如样品对methods-based的处理，对样品重复性和可靠性的评价，以与临床样本用于评估诊断特异性敏感度），每一项都将会需要样品，而其数量会随着实验背景不同而有所变化。以下我们会突出强调对需求量与一些性能分析参数验证的原则。通过使用methods-based评估分析的灵敏度，目的在于最大化突变序列数量，相对于金标准增加分析的可信度。这些数值会外推到所有的碱基。对于这种methods-based，致病性变异分析是无关的，因为这不受技术检测

13、能力影响。然而尽量多的利用基因组中的不同区段去判定基线非常重要，因为序列的背景是一个重要的影响因素。另外实验室应该分别对所有的与检测相关的变异类型进行性能分析判定（如SNV，InDel，CNV，结构变异，homopolymers）。适当的确定变异类型的最大数量的方法可能会包含部不同研发测试的累积分析，前提是用相同的鉴定工具。另外，几个可获取的公共数据库可以提供外显子组或全基因组变异位点的识别，以为临床检测服务。另外疾病预防控制中心和国家生物技术信息中心合作成立，以方便两个测序基因组以与临床靶序列数据的获取。这些数据库提供了变异位点的大量设置，这将有助于得到技术性能规。然而当NGS检测中包含有除

14、了一些更广泛性的methods-based方法外，一个特异型分析的验证是有必要的。由此，阳性对照对于NGS检测所熟识的基因相关的变异位点（如CFTR基因p.F508缺失变异）引起的疾病极为重要的。特异性分析通常需要阴性样品进行计算，去定义负数部分。在整个实验部分methods-based方法可用于特异性计算分析，如假阳性率的判定。在临床样本中它对于判定假阳性数量同样具有作用。注意到特异型分析在I类错误类型的比例，包括碱基识别错误，错位引起的错误，变异识别错误。判定检测限对于一个含有异质基因类型的样品（如肿瘤样品、用于产前诊断的母亲血液，镶嵌样品）查询的实验是非常重要的。考虑到桑格测序过去一直是

15、在验证期间的金标准，但其灵敏度低于NGS，所以对NGS的灵敏度验证具有一定挑战性。样品混合实验（已知等位基因频率的稀释）应该至少用到3个样品（生物学重复）。对于单通道测序仪，部运行的差异性可以通过用相同样本的不同条形码检测（技术重复）。同源序列如假基因可以干扰变异位点识别的精确性，这对正确的去分析受影响的基因形成了巨大的挑战。预先生物信息同源性分析将会有助于确定来自同源序列可能的干扰。另外，图谱质量可以用于确定有疑问的区域。如果这种基因包含在NGS测试中，实验室必须设计一个方法确保被识别到的变异不是假基因序列，并证明这个方法的准确度。当测序池中含有条码接头样品，实验室必须证明整个平台中样品身份

16、的保持。重新验证和认证的程度依赖于所引进的改变的大小与其潜在的影响。例如一些微小的变化，引进新的捕获试剂并已经得到全面的验证，可以通过预期达成的功效进行验证。在这个例子中如果实验室测序一个以前测试过的一个样品并证明其主要运行参数未改变并获得了一致的结果，就可认为这种变化是可承受的。相反的，一个较大的变化，如引进了一个新的测序平台，或不同的靶序列富集方法，那就需要进行全面的从新验证。NGS实验平台质量管理体系NGS实验平台遵循一个文件化的质量管理体系。CAP认可实验室必须发展并遵循一个质量管理计划。CAP所有的共同的检测清单适用于多专科实验室，包含质量管理的各个部分和性能检测方法。NGS实验平台

17、质控管理程序加入到NGS检测清单部分，突出NGS实验室执行的特别需求。没有两个质量管理规程是相似的。每一个都是根据实验室的畴、诊断市场、专业知识而形成的，并给与实验室主任宽泛行动自由去设计质量保障体系。质量管理规程的大纲设计必须设计好，并符合设计类文件。对于NGS实验室，一个好的质量保障大纲应包含以下特征：1. 质量保障体系应遵从工作流程。体系评价应在二代测序、分析检测、序列报告分析发生之前进行。2. NGS质量体系应该与整个机构的质量保障体系相协调，如果这个机构比较大，如医院、医疗中心，NGS的质量体系应适从于整个大的体系中。3. 体系应该能够处理在检测过程中出现的一般性问题。这些问题不但能

18、够影响检测结果，而且使得临床应用与实验室自身政策规程不一致。体系文件中应包含对每次校正的记录、效果、操作准则、流程的修正，以避免问题的复发。4. 质量管理体系宗旨是确保检测具有临床意义。因为没有灵敏度更高的检测进行比较，所以这对于NGS这样的检测尤为重要。检测指示和分析判断的适宜性应有科学的医学证明。5. 规程中应鼓励实验室工作人员对于实验室质量检测的意见进行交流。对工作人员的投诉与建议进行调研必须成为质量保障体系中的一部分。NGS结果验证实验室应有一项规定来文件注明报告中的变异位点的检测验证。虽然NGS技术的准确性在不断提高，但还是普遍认为基于NGS的测序实验会产生假阳性和假阴性的结果。当验

19、证性实验是否要进行时，CAP选择给开展基于NGS测序的实验室一定的灵活性。如检测怎样执行，是否建议对额外的家庭成员进行后续补充检测，哪些可以基于二代测序哪些不可以等。例如，一些实验室认为在实验中测序深度达到标准时（如基于单基因的二代测序达到1000乘），或具有较高的可信度，变异位点就没有必要验证确认。然而，一些实验室认为需要另一种可替代的方法对报告中的变异位点进行验证确认，以达到理想的置信度。另外一些实验室可能会在预定的试用期进行验证确认，过后根据结果再对是否进行验证性实验进行评估。每一个进行NGS测序的实验室必须有一项规程，用来文件解说验证性检测工作，或为何不需要进行验证性工作。基于NGS临

20、床检测与变异位点报告的实验室必须能够文件证明其符合他们的验证性实验规定，或能够展示出对NGS实验不间断的监控证据，以保证在验证期间所达到的基准能够一直保持。CAP也希望在决定用何种方法进行进行验证性试验上给予灵活性。尽管桑格测序可能是最为普遍的验证方法。CAP这样做是为了检验科根据变异类型和频率灵活的选择适宜的验证性检测方法。实验室记录用于实验的方法、仪器、试剂以与需要分析的样品可以通过实验记录进行确认追溯。对于文件证明复杂的实验程序和数学算法与对二代测序分析性能解释，实验运行的综合完整记录是必不可少的。因此，首要的工作框架应包含对已归档的信息的保存，包括每个病人样品分析所用的平台，与实验所用

21、的试剂、引物、测序反应，以便能够追溯。这些记录必须包含靶序列检测的完成情况与其测序深度。同时也有必要记录分析的细节，包括任何报道或对于相关参数的描述，或检测和报告处理中一些其他信息。虽然所有的分析细节不必包含在病人的报告中，但是实验室保存每位病人分析相关的详细信息的文件系统是极为关键重要的。异常记录实验室保存来自于NGS实验平台SOP偏差的病人样本的异常记录。实验室必须文件记录下任何源自SOP的偏差，并对偏差与产生的结果进行解释。样品预期的偏差可能包括对收到的样品或构建的文库未达最正确标准，以与测序文库的浓度未达最正确标准。异常情况可能会与样品质量以与分析过程有关，在样本登记时，需要对样品作出

22、评价以便判断这例样品是否适合进行检验。如果对某一例样品质量有一丝担心，应记录在工作单中，并就其与监管者或实验室主任进行交流。实验室主任可能会继续进行检测，但会将这问题传达给主治医师，并就此进行讨论交流。这种情况的一个案例就是没有在最正确的条件下进行样品运输。对于这例样品的处理决定一般是只有当提取的DNA充足时才会进行下一步的检测。在实验操作过程中，与具体步骤相关的问题应报告给实验室主管或主任。然后才能对检测能否完成进行评估。当故障排出之后，如果质控运行与样品结果适宜，结果可以被实验室主管解读，检测结果是令人满意的。检测问题的方方面面都应完整的记录在异常文件里，包括故障排除，解决方案，以与相关的

23、交流（谁与谁与日期），这些必须并入到月质量保障报告中。有时，实验室SOP自身需要进行修改以改善措辞，使得工序流程更清楚，或者是去除小的误差完善操作流程。在这种情况下，所推荐的修改至少应有两个人的支持，包括开发此项目的实验室主管和与实验工程师或相关专家。在这类修改中，必须经过实验室主任核准，签字署名，注明日期。本质上这并不是一个异常记录，而是一个对实验描述的更正。监控升级用以产生NGS数据的仪器，测序化学反应，试剂或试剂盒等，其相应的监控、执行、文件记载的升级，实验室需加以规。实验室必须意识到升级，确保没有在用废弃掉的方法。实验室必须出具相关政策方案去监管和执行仪器，测序化学反应，试剂或试剂盒等

24、的升级。已经验证的可以提高片段扩增与测序的质量、再现性、准确性的一些新的方法不断地更新发展，这项规应解决NGS测序的实验室去如何确保他们所用的样品文库制备实验是最新的。这项规也应说明监管升级所用的方法以与何时执行一个相关的升级并在临床应用前进一步验证。例如实验室的规应在指定的间隔期（如一季度、半年、一年）进行监控并执行升级，以增强优化实验性能。此外，执行完升级后可能会需要对整个实验平台或相关的实验步骤进行重新验证，相应的设定时间间隔期会更方便。生物信息分析过程对于NGS数据的分析，各种开源代码和商业的生物信息学算法和软件都是可获得的。虽然这些分析工具在不断改善，他们在诊断分析性能方面都有其强项

25、和弱项。在操作上，适用于NGS数据的生物分析过程可以总结为3个主要步骤。第一步是产生一个包含核酸序列的可读文件，每个核苷酸都标定一个与准确性相关的数值（碱基质量分值）。产生的序列文件利用特定仪器软件分析几个基础参数，如运行时的信噪比。序列文件一般以FASTQ文件格式生成，包含每个读取的碱基种类，自身的标识以与每个核苷酸相应的质量分值。FASTQ文件已经变成广泛认可的格式用以NGS领域的信息交流。下一步主要是根据参考序列，对读取的序列进行比对，对于一个典型的人类参考基因组序列，去确定病人的序列与参考序列之间的不同。鉴定的变异类型包含SNV、InDel、CNV以与其它的结构变异。确定的变异根据相应

26、基因或蛋白的功能注释到提供信息中。另外实验室执行或策划研发的独立程序，对特定变异与给出的疾病的临床相关性予以评价。最后，在递交的临床报告中，通过注释的变异位点解读病人的临床表型。对于基因模块和外显子组或全基因组测序，大量变异位点的的排查可以通过对较高的基因型频率来筛减，最后只关注于极有可能对病人有危害并与病症相关的的稀有变异。当以家庭为单位对外显子组或全基因组进行分析时，根据受影响与不受影响的家庭成员，优先考虑变异类型在家族中的共分离。根据人类基因组突变体数据库（如HGMD、OMIM等）与变异相关的疾病的相关信息对变异类型进行等级划分，形成临床报告。开发一个包含生物信息以与对变异位点进行研究注

27、释的综合型诊断流水线，需要整合多个算法和软件应用。就本身来说，实验室必须根据经验选择算法以与软件工具应用到每个分析诊断中。其中多个中间过程需要已知的病人样本和培训数据进行设置，去检测算法和软件的性能。已经制定好的生物信息分析工具和参数设置，实验室需执行生物信息分析验证，通过大量的设定的样本判定分析的灵敏度、特异性和重复性（不同运行，不同仪器，不同操作人员之间的一致性）。用以验证的样品包含以前已经确认过的变异类型。这些变异可以验证生物信息工具与其参数的性能表现（例如，如果对变异的检测是独立的分析，应有较高的特异性和灵敏度，或如果是二次分析进行筛选的实验，需相对较高的灵敏度），按照每个实验室的要求

28、和报告的临床标准，调整或更换工具并进一步进行评价。当一个令人满意的生物信息程序经验证并达标后，NGS实验结果向临床的转化需要实验室将生物信息分析的过程的所有方面进行记录描述，并对此制定一个质量管理体系。对生物信息分析的要求在下面的讨论中将着重讲解。NGS生物信息分析标准操作流程文件实验室应通过SOP的形式对于生物分析中NGS结果的分析注释与报告等流程进行文件化。实验室必须对在NGS结果的分析注释与报告中所用到的算法、软件、数据资料库进行文件化。生物信息分析流程的每一组成部分的文本必须记录并能够追溯（版本控制）。对于每一组成部分，实验室会用到一个基线，默认安装，在发布的个体的生物信息学工具或运行

29、算法方面，利用可替换的配置参数定制路径。无论哪种情况，实验室必须以文件形式记录所有的与默认设置不同的自定义容或者明确指明所用到的参数、路径、数值等。大部分的生物信息分析通过与参考序列进行比对，参考序列的版本号与组装的详细信息都需要明确指出。当描述生物信息路径时，实验室应该以文件的形式记录所有的数据分析，包括每一步输入和输出的文件。对于每一步的正常表现，实验室应该也制定和记录质控参数。例如，首要步骤，一个实验室会决定采纳一套标准，如特定仪器质量过滤后，通过的可读序列数量。变异位点识别的标准是必不可少的，用到的参数阈值包含测序深度，变异位点质量评分，等位基因读取比率。在后期数据筛选的流程和依据也需

30、要表达在SOP文件中。NGS生物信息分析流程验证实验室对生物信息分析的验证生效以与当有变动时对整个分析流程或流程的一部分性能进行从新验证生效。从新认证的程度围由修改变动容而定。正如实验流程一样，在确立一个包含序列分析可读文件的生物信息分析流程时，实验室会经历一个自身不断修正的过程。对于能够完成从测序实验到生物信息分析的整个流程的实验室，生物信息分析路径的验证生效应该包含整体的验证。一旦实验室形成并经验性的确定了最正确操作，并对流程完成了充足的检测，下一步就是再利用含有变异位点的样品产生的序列执行并文件化，进行全面的验证。对于部研发的软件工具或供应商提供的已经锁定的软件工具（如对基础工具没有进行

31、任何修改），这些步骤是必不可少的。对于实验测序平台，需要对充足的样品数量进行分析，去评价其诊断分析的灵敏性，特异性和重复性。样本数量的评估应由实验本身决定。一些参数如基因数量的评估，基因区域的评估，以与需要检测的变异类型最终都应确认控制的数量，良好的特征样品（例如人类基因组单体型图样本或已知的固有的细胞系或设计的变异），或之前诊断过的样品。众所周知，假基因以与与靶序列高度同源的序列的出现对与精确的序列图谱映射，序列比对，与相关的变异识别都有干扰。在一个给定的临床诊断实验中，需要对干扰的程度进行判定。尽管在生物信息分析上高度同源序列的设置调整的挑战，可能会解决掉，但是实验室仍需要设置一个独立的可

32、替代性分析方法去应对这一领域的问题。NGS工作组认为全面详尽的定义假阳性和假阴性对应的错误率是不可行的。然而实验室应该在变异类型上对典型的实例的错误率进行评估。通过对照样品、特征样品可以对这些错误率进行评估。假阳性的错误率可以通过可替代性的测序方法进行确定。假阴性的错误率很难确定，因为其起源于多种情况，包括在给定靶区域测序深度的不足，变异的识别的缺少可能因为质量评分设置较低，序列读取的方向分布（正向、反向）无法满足质控标准。在用一个可替代方法验证变异识别的过程中，通过分析靶序列的侧翼区域去确定这个变异识别流程能否发现所有可能的变异。例如，当用桑格测序确认一个变异时，可以设计引物对，不仅对变异区

33、域进行测序，而且对侧翼序列进行测序，然后就能检测是否存在变异，查找与生物信息分析途径鉴定结果的对应关系。在文库制备时，应用分子编码已成为NGS中的常用做法。实验室需要确定标签序列在混合池中的特异性，并且确认在分析的过程中，能够准确的识别区分标签序列。在索引分析和样品合并时，接收或拒绝一条读长需要设立一标准。例如一些实验室只承受具有索引的读长，且索引序列与建库时所用索引是一致的。对于含有索引序列的读取量的百分数的监测可以测试出来源于其它索引序列污染的存在。这个测试与检测限相关，如在肿瘤样品中确认体细胞突变，生物信息分析途径需要其参数进行评估。可以通过降低含有变异位点的样品浓度验证其检测极限。对于

34、确认变异位点的生物信息分析途径的验证都是专用的，除了分析含有杂合基因型的特殊样品的检测极限外，以上讨论都是与之广泛相关的。当应用外显子或全基因组测序以确认相关的候选基因时，基于此，实验室必须额外的对生物分析途径进行验证。例如，在遗传疾病的情况下，实验室通过对具有多种（隐性、显性、有害变异、致病性变异）序列分析读取设置。一旦生物信息分析途径经过验证符合实验室的要求，并已经实施，当分析途径有任何改变时，需要对其重新验证。能够使其重新生效的实际方法是利用分析验证过的序列文件用新参数对其重新简单地分析。这种方法可能会产生相同的、或更少的、或更多的变异位点，这些结果需要进一步验证。对于外显子组或全基因组

35、的序列，生物分析途径的改变也能产生一个新的假定的候选基因。作为生物分析途径验证或从新验证的法规资料将会包含验证生效记录和临床应用的备用证明文件。NGS信息分析流程-质量管理体系对于NGS信息分析途径，实验室应有一份文件化的质量控制体系。实验室必须依据对应的质控标准来监测NGS数据分析的常规性工作。对临床样品分析时，与预期的质量控制指标的偏离需要调查，并给出解决。一些样品包含以下这些情况：NGS数据分析的生物信息输出可能会显示通过质量评分要求的序列读取数量的不足。另一种情况，根据人类基因组突变频率的相关信息，确定的变异的数量可能会脱离实际期望值。另外的样品具有偏高的索引序列读取的数量，以至于无法

36、专门的分离。这种偏差说明技术上存在误差，或操作过程的失误。一个适宜的质量控制系统提供工作流程，去查明导致差错的可能的原因，并制定适宜的补救措施。如与预期结果相偏差，实验室应记录下来，并以文献的形式记录用来确定原因和修正的相关措施。遵从的证据（法规资料）不仅应包含质量控制监测指标的文件编制，还应有关于偏差与相应研究和补救措施的记录描述。生物信息流程的更新实验室有一个政策针对监控，文件编制，补丁版本的执行，升级和其它生物信息分析途径的更新。检测项目要验室制定并遵循一项程序，对生物分析途径的各部分制定和实施更新。二代测序生物分析途径常常会用到开源代码软件的多个程序包，处理容、报告分析方面的数据库。由

37、于这一领域的不断改进演变，实验室必须有一项政策监控更新，版本补充。这项政策应该注明更新的日期。例如，实验室在相关发布后就执行更新，或在一定的间隔期（一季度，半年，一年）后进行更新，这由更新的性质和相关紧迫性决定。由于在这些更新后需要对生物信息分析流程重新验证生效，后一种方法使得更新与重新验证合并，这将是更有效的。最后实验室保存记录，并能清晰地以文件的形式记录定期的监管执行更新。应着重强调的是，是否更新，何时更新，是由实验室主任决定。数据储存实验室有一个规定，与生物信息分析途径产出的数据，中间的数据，以与最终的数据储存有关。实验室必须确立并执行关于数据储存的一项规定。NGS产生的大的数据文件以与

38、相关的数据分析，包括流动细胞成像文件，序列碱基识别和相应质量评分序列读取文件，以与随后分析中产生的中间文件。通常在一段较长时间保存所有的文件是不实际的，所以清单要求授权实验室确立一项关于数据储存的规定，指定的数据文件保留时间，与最终报告之后哪些文件需要保存。NGS工作组建议，如果可行的话，实验室保留含有质量评分的序列文件（如FASTQ文件）或保存一个能够再生的文件档案（如BAM文件）。这些格式将会允许在后来重新分析。对于全基因组或其它较大的序列数据，保留FASTQ文件或标准档案格式较长时间将会花费较高的费用，然而，新的压缩格式提供了一个近期的解决方案。这些文件要保存多长时间是一个复杂的问题，与

39、文件大小，实验室文件储存能力，法医学考虑，地方、地区、国家对数据储存的要求。最后必须强调数据文件的储存时间与地方、地区、国家对数据储存的要求保持一致。版本的可追溯性利用NGS数据文件，生物信息分析途径的特定的版本对于每个病人的报告都是可以追溯的。用于NGS数据分析的特定版本的组成部分，从哪获得，相关的配制（命令行参数或其它配制项）都能够被追溯。之前已经提到，对于应用生物信息分析流程去分析NGS数据，尤其是主要基于开源代码的软件时，其经常由多个程序包、脚本、数据库组成。单个的软件包或脚本性能，置的或外部的数据库对于整个生物信息分析的性能具有重要的影响。因此，利用特定的生物分析流程对每个病人的数据

40、进行分析，并生成报告是极为重要的。对于部产生的脚本和软件包，如有改动也应以文件形式记录，但是这些不必要出现在病人的报告中。总的来说，应用特定实验室指定的分析流程（如：NGS流程V1.0.1）作为参考是可以被承受的。对于单个的组件和配置的组合，特定实验室指定的流程应该是独一无二的。因此，软件程序包、脚本、或部外部的数据库的不同的版本的改变，需要一个新的独特的特定实验室并对其重新验证。异常记录实验室利用生物信息分析流程分析过程中，对病人案例的偏离SOP的异常日志进行保存维护。在生物信息分析流程分析过程中，与SOP有任何的差异都应该以文件从形式记录在异常日志中，包括软件包、脚本、版本号、数据库、命令

41、行或相关参数的改变。在生物信息分析流程分析过程中，任何运行失败都应记录在异常日志中，包括问题，结果调查，所进行的修改，相互的交流，实验室主任的签署，委派人员等。异常日志要求与病人的报告保持联系，实验室主任可以选择任何相关的SOP偏差与咨询医师进行交流。异常日志的文件化也应并入到质量保障月报告中。一些偏差，例如由于网络、电脑或储存失败需从新运行的，或需要不同的参数运行一个特定的步骤，必须文件记录其结果输出和解释。例如，一个实验室可能会需要在特定工具里改变设置以充分的对一个病例的某一变异或基因区域进行充分的分析。偏差的原因的描述，以与产生偏差的特殊部分应记录在异常日志中。每一个偏差应到对应病人案例

42、中，由实验室主任给出恰当的评价。由于有担保，这种偏差可以包含在最终的报告中，或详细的与咨询医师进行交流。在进行生物信息分析时与漏洞或故障相关的偏差需要记录在异常日志中。漏洞、受影响的案例，提出的矫正措施，必须经过实验室主任审核批准，签字，注明日期。可能由于硬件或软件或操作失误导致生物信息分析完全的失败，也应该记录在异常日志中，并以文件形式记录出现的错误。NGS数据传送的性实验室应有一项规程，在NGS数据在部或外部的储存、传送时保持时，应确保病人信息的和安全。二代测序产生的大量的数据，尤其是基因测序，含有病人的，出生日期，用药数量记录或其他的受保护的健康信息，用以对病人的身份鉴定。实验室必须建立

43、严格的程序确保病人的私人信息受到保护。实验室必须强化一些关于基因组信息传送给医疗保健机构或第三方机构（如提供云计算资源或实验室服务类的机构）的规程。规程中应包括数据加密，安全数据传送，访问时的用户身份识别鉴定。实验室应该遵照健康保险携带和账户行为能力的标准要求，例如与外部供应商建立商业协议，包括严格的充分的评估适宜的方法保障病人临床基因组数据发送和接收的性。序列变异位点的解释报告对变异位点的解释和报告应遵循专业机构推荐的指导方针。随着NGS技术的采用，临床实验室正在扩大他们的检测项目，如从单基因到基因模块再到外显子组，再到全基因组。显而易见的，实验室将对多个关键的在以前报道中引起疾病的变异位点

44、进行NGS测序。目前，大部分的基因变异的实验报告都是遵循人类基因组变异协会命名法以与来自美国遗传医学协会（ACMG）的变异分类指导方针。术语命名的参考最初由Antonarakis和Dunnen在2001年发布，但目前已经发生显著地变化与附加上一些容。因此，建议实验室采用这些参考指南的最新网络版本。ACMG的变异分类的参考方针目前正在修订，新版本将包含变异位点的解释的参考容。建议应用ACMG的对于遗传疾病的分类系统作为参考，以提高变异位点分类的一致性。疾病和基因特异性修饰将应该记录在案。对于其他临床基因组检测（肿瘤或病原体诊断），实验室应该对变异分类持有最正确的判断，并采纳现有的参考指南。在一些

45、文献中存在混淆的地方，如何使用副本文字进行变异的编号缺乏一致性，在临床报告中也是如此。如由基因MUTYH产生的多个转录本，利用复杂的命名法去描述基因中的突变位点。其中两个主要的转录本是hMYHa1（NM-012222.2）和hMYHa3（NM-001048171.1），由546和535个氨基酸组成的多肽。由于第3外显子的可变剪切造成hMYHa3比hMYHa3少33个核苷酸，修剪掉第3外显子5端11个氨基酸（GMIAECPGAPA）。大多数文献命名突变体时用的是hMYHa3，然而一些文献利用全长转录本hMYHa1进行命名。当对基因MUTYH出具检测报告时，或来自不同实验室对其的报告进行比较时，注

46、明应用哪一个转录本进行命名是极为重要的。实验室已经将这两个最常见的转录本命名为p.Tyr165Cys和p.Gly382Asp。在临床报告中，当有名称变化时，实验室应该有一套机制去监管此类事情，并给予高度的重视。因此为了避免混淆，报告中要注释所用转录本的检索号与对应的蛋白排列。在一个样本中，对序列变异的观察的精确解释对于临床检测是极为重要的，因为它整合了变异对于功能基因所有可能的破坏和病人的临床表型，以确定是否是这个变异引起的疾病。在过去的几年里，不同的名词术语已经应用到临床报告中，这意味着测序结果在不断变化，包括致病性的，有害的，疾病相关联的，并带有possible，probably，like

47、ly，VUS和VOUS（未知的临床意义，未确定的临床意义）修饰词。标准的序列变异参考已经推荐给遗传类疾病，但对于肿瘤和传染性病原体诊断仍然是不牢靠的。对于遗传疾病，最普遍的应用的分类分为5个类别，（1）致病性的，（2）可能致病性的，（3）不确定的临床意义，（4）可能良性的（5）良性的。当描述序列变异造成的临床影响时，实验室应引起重视，并仔细的考虑疾病因果关系的证据，普通人群中的频率，以与相关功能性研究。从大的工程项目（外显子组变异服务器，千人基因组计划等）里免费的获得外显子组或全基因组测序数据后，实验室应该利用相关的数据库和计算机工具（如表所示）去注释序列改变对疾病的影响程度。对于大规模的检测

48、，如外显子测序或全基因组测序，一个基因对疾病的因果关系的证据的评价，以与对变异类型、遗传形式的理解是非常重要的。例如没有确定在发病中有具体作用的一个基因的功能性缺失变异，不可以假设其引起疾病。附带性遗传研究报告与临床诊断目的无关的附带性遗传研究报告，实验室应对此进行规。当进行单基因、基因模块、外显子、全基因组测序测序时，临床上会产生重要的遗传研究发现，但与检测的表现型无关。这种现象同样也会出现在对某种特定疾病进行特定分析的情况中。其可能会包含识别与常染色体显性疾病，隐性疾病携带状态，普遍已知的药物反应等位基因标记有关的变异。着手利用NGS的临床检测，应该意识到这种偶然的研究发现的潜力，并且对于

49、是否以与如何报告这些这些实验检测应该有相关规定。最近公布的ACMG推荐规，去报告医学上可操作的偶然发现，其中包含一个最低量的基因，如果发现已知的突变位点，就应出具其报告。实验室可以选择遵循ACMG的推荐，但并不是期望一定要报告在这些基因中的发现。实验室就偶然的发现，可以制定自己的规。如果实验室的规不对偶然性发现进行报道，或者限制对一特定疾病报告偶然的发现，对于此实验室应该清楚在检测报告中声明。当决定是否透漏给病人某一遗传信息时，道德准则也应考虑进来。公开附带性发现相关的安全等级由疾病的严重程度、临床可控程度、或其它风险效益因子决定。例如，常见的疾病风险等位基因，2型糖尿病，相较于遗传信息说明倾

50、向于医学上可以或不可以治愈的恶性肿瘤或孟德尔遗传病而言，具有相对较低的风险，或药理学风险信息具有不同后果严重程度。所有的这些方面在将信息反馈给病人时都应该考虑到。NGS检测的转诊（外包）政策实验室应制定相关政策，用以规在NGS检测转诊时，选择参考实验室或其它服务供应机构。转诊可以包括整个的NGS检测进程或仅仅是实验室操作进程和生物信息分析进程的某一个。带有数据分析挑战性的复杂的NGS临床检测导致了传统实验检测模式的转变。尽管大多数临床实验室部进行全部的NGS检测进程，目前已有不断增多的实验室将检测的部分进程外包给外部的公司。例如，CLIA实验室不进行大量的数据分析能力，将生物信息分析流程外包给

51、外部公司。另一方面，生物信息供应商或相关机构具有较高的数据分析处理能力，但是不具有CLIA实验设施，将实验室操作进程外包给外部实验室。随着这种临床工作流程分工成为一种趋势，NGS工作组决定对2014版的NGS检测单加入一个应对转诊规定的要求。CAP实验室检查要求单41350写明，实验室主任对于选择外部参考实验室或服务商负有责任。实验室主任应保证外部实验室操作进程或生物信息分析服务的性能质量。在一些具体的方面，实验室主任应考虑选择外部参考实验室或服务商以保证（1）能够完成临床检测的周期对于临床需求来说是可承受的；（2）外部实验室提供的实验室操作进程是经CLIA验证的或能够满足CAP要求的标准；（

52、3）外部生物信息分析结果的质量和准确性已通过高标准的验证。备注在过去相当短的一段时间，NGS已经由基础临床研究转化到临床诊断。应用NGS进行多基因模块、外显子组、全基因组测序的临床诊断实验室正在不断增长。CAP确定了采用NGS的临床实验室需要制定针对于NGS的认证要求。本文突出介绍了由NGS工作组制定的资格认可要求的容，并清楚地讲解工作组在发展这种临床需求的视角。NGS领域仍在继续快速的演变提升，反映在仪器、试剂、分析工具与软件的升级。工作组以NGS资格认证要求的视角，应用基本的临床诊断要求，促培临床实验室采用NGS的责任，确保病人的安全。这些原则包括流程步骤的文件化，通过适当的验证示证明实验

53、室规程，制定质量管理体系。考虑到实际上技术的快速变革，以与基于NGS检测类型、分析规模的不同，NGS工作组针对不同的NGS临床检测制定了一些常规要求，并允许实验室灵活的规各自的方法途径以满足要求，另外同时提供了相当多的监管标准。应用于本文中的与命名、解释、与附带性结果报道适用于应用NGS技术进行遗传疾病检测。在之前处理关于单基因遗传病检测的认证需求时，实际上已经非常明确的制定了实验室标准。尤其是关于命名术语，变异位点的解释，意外发现等，在之前都已有发布。工作组选择稍晚的对NGS的要求进行介绍，以便有益于更好地技术革新，并在专业领域水平上形成共识。在推出一个相关的认证要求前，关于体细胞变异注释的

54、指导手册需要制定出来。出于对体细胞变异解释指导手册的要求，NGS多基因模块和外显子检测已经被着重提出。基于NGS的分子肿瘤的认证要求包括样品分析前的评价，以与对NGS检测结果的影响。分析前的一些指标，如福尔马林固定，石蜡包埋等对于结果的影响并没有被确定，因此委员会认为太具体的制定这些特殊要求为时尚早。由于基于NGS的诊断学不断进化和成熟，NGS工作组认为NGS的认证要求需要回访并修订。随着资格认证的发布出版，CAP在执行时随后有许多来自于实验室的问题。特别是实验室定期的寻求关于需求的说明，形成的问题为工作组提供反馈，指引讨论关注与改善和澄清这些要求。另外，NGS工作组认识到最初制定的认证要求不能覆盖全部临床实验室NGS追求的应用。操作上，NGS工作组经过了整整一年的时间进行会议和面对面会议。讨论作为这些活动的一部分，重点关注于修正扩充认证要求。随着CAP认证要求的周期性修订和出版，NGS工作组有能力正式的提交修订和扩展NGS认证要求。当前的认证要求已经经过一次正式的修订，额外的修订和扩充正在进行。工作组对反馈和此领域的经验进行进一步的商议，未来的NGS相关认证版本会不断的被修改和更新。18 / 18