病毒检验技术学习教案

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1、会计学1病毒检验技术病毒检验技术第一页，编辑于星期日：十八点 二十二分。第一节 标本的采集、处理与运送 1第二节 病毒的分离与鉴定2第三节 病毒学检测及诊断3第1页/共39页第二页，编辑于星期日：十八点 二十二分。第2页/共39页第三页，编辑于星期日：十八点 二十二分。第3页/共39页第四页，编辑于星期日：十八点 二十二分。第4页/共39页第五页，编辑于星期日：十八点 二十二分。第5页/共39页第六页，编辑于星期日：十八点 二十二分。第6页/共39页第七页，编辑于星期日：十八点 二十二分。采集时无菌操作,可加入抗生素以杀死杂菌第7页/共39页第八页，编辑于星期日：十八点 二十二分。第一节 标本

2、的采集、处理与运送 第8页/共39页第九页，编辑于星期日：十八点 二十二分。n 不同的病毒分离时采用不同的分离方法,这主要取决于目的病毒的生物学特性。n 主要有细胞培养法、鸡胚培养法、动物接种法等,而对细胞、鸡胚不敏感,又没有合适动物模型的病毒,可采用基因克隆的方法。第二节 病毒的分离与鉴定第9页/共39页第十页，编辑于星期日：十八点 二十二分。第二节 病毒的分离与鉴定原代细胞培养二倍体细胞培养传代细胞 羊膜腔接种尿囊腔接种卵黄囊接种绒毛尿囊膜接种组织细胞培养 鸡胚培养 动物接种是将离体活组织块或分散的组织细胞加以培养的技术总称，为病毒分离鉴定中的最常用的基本方法。第10页/共39页第十一页，

3、编辑于星期日：十八点 二十二分。（一）组织细胞培养 鸡成纤维细胞Hep-2细胞细胞培养瓶Vero细胞第二节 病毒的分离与鉴定第11页/共39页第十二页，编辑于星期日：十八点 二十二分。第12页/共39页第十三页，编辑于星期日：十八点 二十二分。第13页/共39页第十四页，编辑于星期日：十八点 二十二分。152.鸡胚培养第二节 病毒的分离与鉴定鸡胚培养法是用来培养某些对鸡胚敏感的动物病毒的一种培养方法，此方法可用以进行多种病毒的分离、培养，毒力的滴定，中和试验以及抗原和疫苗的制备等。第14页/共39页第十五页，编辑于星期日：十八点 二十二分。16一般选用914d的鸡胚来源充足、组织分化程度低、本

4、身很少携带病毒和细菌、对接种病毒不产生抗体及病毒较易增殖等2.鸡胚培养优点：第二节 病毒的分离与鉴定第15页/共39页第十六页，编辑于星期日：十八点 二十二分。选择不同的接种部位是病毒分离成功的关键常用的主要有： 尿囊腔接种、羊膜腔接种、卵黄囊接种、绒毛尿囊膜接种2.鸡胚培养第二节 病毒的分离与鉴定不同病毒在鸡胚的不同部位的生长特性差异很大第16页/共39页第十七页，编辑于星期日：十八点 二十二分。2.鸡胚培养尿囊腔接种羊膜腔接种尿囊腔羊膜腔常用接种途径： 尿囊腔接种、羊膜腔接种、卵黄囊接种、绒毛尿囊膜接种常用于流感病毒、流行性腮腺炎病毒和新城疫病毒的适应和传代培养常用于临床流感病毒初次分离第

5、二节 病毒的分离与鉴定第17页/共39页第十八页，编辑于星期日：十八点 二十二分。卵黄囊接种绒毛尿囊膜接种卵黄囊绒毛尿囊膜人工气室羊膜腔气室绒毛尿囊膜尿囊腔 卵白2.2.鸡胚培养主要用于虫媒病毒、衣原体及立克次体的分离和繁殖。常用于牛痘病毒、天花病毒、单纯疱疹病毒的分离卵卵黄黄囊囊第二节 病毒的分离与鉴定第18页/共39页第十九页，编辑于星期日：十八点 二十二分。3.动物接种常用的实验动物有小白鼠、乳鼠、豚鼠、家兔、猴和鸡等常用的接种途径包括皮下、皮内、腹腔、静脉、角膜、鼻腔及脑内接种等方式第二节 病毒的分离与鉴定第19页/共39页第二十页，编辑于星期日：十八点 二十二分。二、病毒增殖的观察（

6、一）病毒在细胞内增殖的鉴定指标 1细胞形态的改变 2红细胞吸附 3细胞培养液pH值改变（二）病毒数量及病毒感染性测定 1血凝试验 2中和试验 3空斑形成试验 4半数感染量（ID50）和组织培养半数感染量（TCID50） 第二节 病毒的分离与鉴定第20页/共39页第二十一页，编辑于星期日：十八点 二十二分。二、病毒增殖的观察（一）病毒在细胞内增殖的鉴定指标 1细胞形态的改变 （1） 细胞病变效应（cytophathic effect，CPE）第二节 病毒的分离与鉴定第21页/共39页第二十二页，编辑于星期日：十八点 二十二分。正常细胞 病变细胞是指某些病毒特别是无包膜的病毒感染组织细胞后，正常生

7、长的梭形细胞变圆、变性、坏死、溶解及从培养瓶壁脱落，细胞堆积形成葡萄状第二节 病毒的分离与鉴定第22页/共39页第二十三页，编辑于星期日：十八点 二十二分。（2）多核巨细胞1细胞形态的改变多见于有包膜的病毒，如呼吸道合胞病毒、麻疹病毒等，由感染细胞融合而成多核巨细胞第二节 病毒的分离与鉴定第23页/共39页第二十四页，编辑于星期日：十八点 二十二分。（3）包涵体1细胞形态的改变 某些病毒感染宿主细胞后，细胞内出现一种光学显微镜下可见的蛋白质结构，多为圆形、卵圆形或不定形。一般是由完整的病毒颗粒或尚未装配的病毒亚基聚集而成，称为包涵体。第二节 病毒的分离与鉴定第24页/共39页第二十五页，编辑于

8、星期日：十八点 二十二分。2红细胞吸附有些病毒感染细胞后,细胞膜上可镶嵌着病毒基因编码产生的糖蛋白,其中有些能吸附特定种类的红细胞,或将细胞培养单层刮下后,经过适当处理,可以凝集特定种类的红细胞,此类糖蛋白在细胞表面形成刺突,称为血凝素。3细胞培养液pH值改变二、病毒增殖的观察病毒感染细胞后，可使细胞的代谢发生变化，导致培养液pH值改变。第二节 病毒的分离与鉴定第25页/共39页第二十六页，编辑于星期日：十八点 二十二分。（二）病毒数量及病毒感染性测定二、病毒增殖的观察1血凝试验 病毒颗粒红细胞 某些病毒（如流感病毒）表面的血凝素（HA）能引起人或某些哺乳动物的红细胞发生凝集，将这类病毒感染细

9、胞后收集的病毒液作不同稀释，以发生血凝反应的病毒液的最高稀释度作为该病毒的血凝效价（即滴度），可对病毒含量进行半定量测定。血凝现象第二节 病毒的分离与鉴定第26页/共39页第二十七页，编辑于星期日：十八点 二十二分。能使红细胞完全凝集的病毒的最高稀释倍数为该病毒的血凝效价，此效价为1个血凝单位（HAU）第二节 病毒的分离与鉴定第27页/共39页第二十八页，编辑于星期日：十八点 二十二分。病毒颗粒 红细胞病毒抗体 血凝抑制试验 病毒液中若先加入病毒的特异性抗体，抗体与病毒表面的抗原特异性结合，从而抑制病毒与红细胞的血凝现象，称为血凝抑制试验。第二节 病毒的分离与鉴定第28页/共39页第二十九页，

10、编辑于星期日：十八点 二十二分。2中和试验（Nt） 在体外孵育病毒与特异性抗体的混合物，使病毒与抗体相互反应，再将混合物接种到敏感的宿主体内，经培养后观察CPE或红细胞吸附现象是否消失，即特异性抗体是否中和相应病毒，从而测定残存的病毒感染力的一种方法3空斑形成试验第二节 病毒的分离与鉴定第29页/共39页第三十页，编辑于星期日：十八点 二十二分。n是一种检查和准确测定病毒滴度的方法。n将稀释的病毒悬液加入单层细胞培养瓶中。病毒吸附后，再覆盖一层融化的半固体营养琼脂，使病毒在单层细胞培养中有限扩散。n 结果是每一个有感染性的病毒在单层细胞中可产生一个局限性的感染灶。用活性染料 (如中性红) 染色

11、，则活细胞着色，受病毒感染而破坏的细胞不着色，形成肉眼可见的空斑/蚀斑(plaque)。n每个蚀斑是由一个感染性病毒颗粒形成的，称作空斑形成单位 (plaque forming unit, PFU)。n病毒悬液中的感染性病毒量的滴度可用PFUml表示。第30页/共39页第三十一页，编辑于星期日：十八点 二十二分。4半数感染量（ID50）和组织培养半数感染量（TCID50） 测定病毒感染鸡胚、动物或细胞后，引起50%死亡或病变的最小量。用来估计病毒感染的强弱程度，但不能准确测定感染性病毒颗粒的多少第二节 病毒的分离与鉴定第31页/共39页第三十二页，编辑于星期日：十八点 二十二分。第32页/共3

12、9页第三十三页，编辑于星期日：十八点 二十二分。2. 电子显微镜检查： *透射电子显微镜 用于观察病毒的大小、形态与结构及细胞内的超微结构等*扫描电子显微镜： 用于观察病毒和细菌表面结构和附属结构等 一、形态学检查及诊断扫描电子显微镜 第三节 病毒学检测及诊断第33页/共39页第三十四页，编辑于星期日：十八点 二十二分。H1N1流感病毒电子显微镜图片狂犬病病毒电子显微镜图片 第三节 病毒学检测及诊断第34页/共39页第三十五页，编辑于星期日：十八点 二十二分。（1）标本制备 超滤法超速离心法接种细胞快速增殖法免疫凝集法（2）常用观察方法 负染色法 超薄切片法 免疫电镜法病毒颗粒具有亮度，在周围

13、较暗的背景上显示亮点过程与病理切片过程相似免疫组织化学与电镜技术的结合透射电子显微镜 第三节 病毒学检测及诊断第35页/共39页第三十六页，编辑于星期日：十八点 二十二分。 第三节 病毒学检测及诊断第36页/共39页第三十七页，编辑于星期日：十八点 二十二分。2.病毒抗体的检测：已知病毒抗原多数为通过基因工程技术制备的重组抗原，其次是从患者标本中分离纯化的抗原。检测抗体的类型确定患者所处感染阶段-急性期单份血清的IgM测定是诊断原发感染和早期感染-IgG含量的测定应取病人急性期和恢复期双份血清，若含量升高4倍以上表明感染病毒 第三节 病毒学检测及诊断第37页/共39页第三十八页，编辑于星期日：十八点 二十二分。 第三节 病毒学检测及诊断第38页/共39页第三十九页，编辑于星期日：十八点 二十二分。