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1、 jjjjdj 黑曲霉的分离筛选一、实验简介黑曲霉广泛分布于世界各地的粮食、植物性产品和土壤中。黑曲霉的最适温度为37，黑曲霉对营养要求较低,只要培养基中含有碳源、氮源及磷、钾、镁、硫等元素即能生长良好，实验中采用察氏培养基进行培养。黑曲霉的菌落蔓延迅速，但生长稍局限，菌丝初为白色，后变成鲜黄色直至黑色厚绒状，背面无色或中央略带黄褐色。顶部形成球形顶囊，其上全面覆盖一层梗基和一层小梗，小梗双层褐色，梗基较短，上长有成串褐黑色的球状分生孢子。孢子直径2.54.0m。分生孢子头球状，直径700800m，褐黑色。黑曲霉的个体形态和菌落形态都比较特殊，容易分辨，可利用平板划线法或稀释涂布法，得到单菌落
2、，并结合显微镜检测，多步鉴定、纯化，得到的纯的菌种。二、实验试剂与材料1、材料：黑曲霉孢子悬浮液2、溶液和试剂： 硝酸钠、磷酸氢二钾、硫酸镁、氯化钾、硫酸亚铁、蔗糖、琼脂、1mol/L氢氧化钠溶液、1mol/L氯化氢溶液、75%乙醇、乙醇乙醚混合液、溴甲酚绿、水。3、器材和其他用品： 三角瓶、试管、搪瓷杯、培养皿、接种环、酒精灯、高压蒸汽灭菌锅、试管架、载玻片、盖玻片、光学显微镜、恒温培养箱、纱布、牛皮纸、滤纸、pH试纸、擦镜纸。三、实验步骤和过程1、无菌器材及无菌水的准备1.1 培养皿：洗净的培养皿烘干后，每组将5套培养皿叠在一起，用报纸卷成一筒，然后进行灭菌。注意，一定要卷紧。1.2 试管
3、：做合适的棉塞，每组捆扎5支试管，用报纸包在一起后，用线绳扎紧，扎成活结，另一头再用皮筋扎好，然后进行灭菌。1.3 三角瓶：在三角瓶瓶口塞一八层纱布，盖上牛皮纸，用线绳扎成活结，然后进行灭菌。注意，装入的培养基不超过三角瓶的1/2。上述物品均要用记号笔注明班级、组别、日期。1.4 高压蒸汽灭菌2、查氏培养基的配制称量熔化定容调pH分装加塞包扎标记灭菌搁置斜面与倒平板无菌检查培养基配方：硝酸钠 3g 磷酸氢二钾 1g 硫酸镁（MgSO4H2O）0.5g 氯化钾 0.5g 硫酸亚铁 0.01g 蔗糖 30g 琼脂 20g 蒸馏水 1000ml pH5.0-6.02.1 称量：按照培养基配方，依次准
4、确地称取药品，放入搪瓷杯中。2.2 熔化：量取自来水，加入所需水量的一部分至上述搪瓷杯中，用玻璃棒搅拌，待药品溶解后，加入琼脂，倒入余下的水，在电热板上加热熔化。2.3定容：将加热后的培养基导入量筒中，用自来水进行定容，至1000ml。2.4 调pH：待培养基稍冷却后，用精密pH试纸测量培养基的原始pH，若偏酸，用1mol/L NaOH边滴加边搅拌，使之达到pH5.0-6.0。若偏碱，则用1mol/L HCl调节。2.5 分装：用分装装置将培养基装入试管，高度为试管总长的1/5，共20支。余下培养基转入三角瓶中，培养基的量为三角瓶容量的1/3-1/2。2.6 加塞、包扎、标记：试管加棉花塞，5
5、支一捆包扎好，棉塞外加一层报纸防灭菌时冷凝水湿润棉塞，在外用线绳扎成活结，；三角瓶用纱布塞住瓶口，并用牛皮纸的线绳包扎好。用记号笔注明培养基名称、班级、组别、配制日期。2.7 灭菌：0.1MPa，121，20min高压蒸汽灭菌。2.8 搁置斜面：待已灭菌的试管培养基冷却至50左右，将试管口端搁置在有合适高度的器具上，使培养基斜面长度不超过试管总长的一半为宜。2.9 倒平板：待三角瓶中培养基冷却至50左右，倒平板。2.10 无菌检查：灭菌培养基放入37培养箱中一天，若无细菌污染则说明灭菌彻底。3、菌种分离纯化3.1 用接种环从黑曲霉孢子悬浮液，接种于小试管斜面中培养（5支）。然后放37培养箱中培
6、养24小时。3.2 平板划线：左手拿平板，右手拿接种环在火焰上灭菌后沾取菌液或菌苔一环，在平板上划平行线三条，接种环在火焰上灭菌，左手转动平皿约70度，用无菌接种环通过第一次划线的末端作为起点作二次划线，依次作第三次、第四次划线（平行线划线法）。或将挑取有菌的接种环在平板培养基上作连续划线。培养：合上皿盖，倒置培养皿于37培养24小时。挑菌落：挑取单个菌落的菌苔少许，涂在载玻片上进行显微镜个体形态观察，结合菌落形态特征综合分析。若不纯，需再用平板划线法继续进行分离纯化。四、 实验分析与检测1、 黑曲霉菌落特征 孢子呈圆球状，淡灰黑色，数目较多，清晰明显，个体较大。2、 菌落计数情况培养平板12
7、345678菌落数182016513179243、 菌落形态特征第一天：直径约为5mm的菌落，扁平状，菌丝呈绒毛状，白色。第二天：菌落变大，菌丝基部白色，顶部浅黄色。第三天：菌落更大，菌丝基部浅黄色，顶部形成黑色球状形顶囊（即分生因子），菌丝密集，菌落呈现黑色。4、 结果分析 黑曲霉生长条件要求低，生长繁殖能力强，在平板上生长后，其他微生物难以生长繁殖，故黑曲霉较易实现扩大培养及分离纯化，对于利用黑曲霉进行工业发酵，如柠檬酸发酵具有一定意义。五、 实验存在的问题及建议1、 在分装培养基时，注意不使培养基沾在瓶口或管壁上端，浸湿棉塞，以免引起杂菌污染； 2、接种、分离时，要在无菌环境下进行（靠近火焰），手不可触摸试管口端，以防烫伤，接种环不要碰触试管口边，防止污染。划线接种时，动作要轻，不要划破培养基。平板培养微生物时要倒置培养。 3、在显微镜观察黑曲霉菌时，使视眼中的黑曲霉菌数维持在10到30个左右。
c27黑曲霉培养及分离纯化
