酶免及胶体金检测试剂介绍--课件

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1、酶联免疫检测技术简介酶联免疫检测技术简介万泰各项产品简介万泰各项产品简介1ppt课件一、酶联免疫技术的基础及特点一、酶联免疫技术的基础及特点2ppt课件什么是什么是ELISA?免疫测定（immunoassay，IA）是应用免疫学技术测定标本的方法。在临床检验中主要通过抗原抗体反应检测体液中的抗体或抗原性物质。ELISA是一种免疫测定。3ppt课件基础定义基础定义抗原（Antigen）：能在机体中引起特异性免疫应答的物质。抗体（Antibody）：能与抗原特异性结合的免疫球蛋白(immunoglobulin,Ig)。Ig分五类，即IgG、IgA、IgM、IgD和IgE。与免疫测定有关的Ig主要为

2、IgG和IgM。机体被微生物感染后，先产生IgM抗体，然后产生IgG抗体。经过一段时间，IgM抗体量逐渐减少而消失，而IgG抗体可长期存在，在疾病痊愈后可持续数年之久。4ppt课件重要指标重要指标灵敏度：能检测到的分析物的最小量，表示检测下限的能力。特异性：鉴别阴性标本的能力。精密度：指对同一个标本进行重复分析，其结果间的符合率。5ppt课件重要指标重要指标稳定性：指在效期内试剂质量参数的变化。一般用非储存条件下较高温度进行破坏性实验数天，参观各质量参数的变化，一般37 1天相当于445天。质控血清：指为了对实验结果进行控制而配制的血清。一般用无溶血无脂血的血清或血浆。本底：指底色，如HbsA

3、g ELISA试剂盒，阳性显色、阴性不显色，本底就是阴性显色的情况；6ppt课件ELISA检测方法检测方法 1.夹心法.2.间接法.3.竞争法.4.捕获法.7ppt课件夹心法夹心法双抗原夹心：固相(包被)抗原Ag+样品(抗体Ab)+酶标抗原Ag*Ag-Ab-Ag*+底物(TMB)显色双抗体夹心：固相(包被)抗体Ab+样品(抗原Ag)+酶标抗体Ab*Ab-Ag-Ab*+底物(TMB)显色8ppt课件夹心法图解夹心法图解TMB+H2O2TMB+H2O2显 色样品酶标抗原加样 洗涤 加酶包 被底物包被抗原21114233360303045554洗涤一步法二步法9ppt课件间接法间接法固相(包被)抗原

4、Ag+样品(抗体Ab)+酶标二抗Ab*Ag-Ab-抗Ab*+底物(TMB)显色10ppt课件竞争法竞争法固相(包被)抗原Ag+样品(无抗体Ab)+酶标抗体Ab*Ag-Ab*+底物(TMB)显色 11ppt课件捕获法捕获法固相-抗IgM抗体(抗抗)+样品(IgM)抗抗-IgM+酶标抗原Ag*抗抗-IgM-Ag*+底物(TMB)显色 12ppt课件检测方法检测方法优点优点缺点缺点酶联免疫酶联免疫EIA高灵敏度及特异性，高灵敏度及特异性，结果准确性高，成结果准确性高，成本底。本底。操作时间长。操作时间长。胶体金胶体金特异性高，操作简特异性高，操作简便。便。灵敏度低。灵敏度低。化学发光（包括电化学发光

5、（包括电化学发光）、时间化学发光）、时间分辨分辨灵敏度高。灵敏度高。需要较高的设备条需要较高的设备条件和操作技术，特件和操作技术，特异性一般。异性一般。PCR可检测标本中极低可检测标本中极低浓度的病毒，窗口浓度的病毒，窗口期短。期短。价格昂贵。价格昂贵。与其他检测方法比较与其他检测方法比较13ppt课件二、万泰各项产品简介二、万泰各项产品简介14ppt课件1、HIV15ppt课件HIV ELSIA试剂的发展试剂的发展16ppt课件简介全称：人类免疫缺陷病毒HIV（1+2型）抗体诊断试剂盒方法：双抗原夹心酶联免疫法（第三代）检测对象：血液标本中的HIV总抗体原料：基因重组（万泰和厦大合作研制），

6、包被GP41、GP120、GP36，片段齐全。检测窗口期：20天左右17ppt课件优异的自产原料优异的自产原料1.1.大肠杆菌表达大肠杆菌表达高活性、高特异性水溶性水溶性抗原；抗原；2.2.多表位多表位表达蛋白抗原；表达蛋白抗原；3.3.相同表位的包被、标记抗原采用不同菌体表达，相同表位的包被、标记抗原采用不同菌体表达，不同方法纯化；不同方法纯化；18ppt课件基基 因因 重重 组组 多多 表表 位位 嵌嵌 合合 抗抗 原原19ppt课件20ppt课件对对HIV-2型阳性出色的检测能力型阳性出色的检测能力试剂盒内设置有HIV 型和型阳性对 照，为国产试剂首创，我们使用美国BBI 血清盘Pane

7、l202对万泰试剂进行考核。21ppt课件 对对HIV O亚型的检测亚型的检测O亚型血来源于美国BBI22ppt课件灵活、稳定的操作模式灵活、稳定的操作模式实验温度可以设置在371。两步孵育时间均为302分钟。操作更灵活，试验更稳定，结果更可靠。23ppt课件超强的抗干扰能力超强的抗干扰能力临床研究显示，多种其他疾病潜在干扰因素血清标本均不会影响万泰两步法HIV诊断试剂盒的灵敏度和特异性，适合临床使用24ppt课件潜在干扰因素血清潜在干扰因素血清标本数标本数阳性数阳性数阴性阴性数数甲型肝炎（HAV）78078乙型肝炎（HBV）4450445巨细胞病毒（CMV）30030T淋巴白血病病病毒（HT

8、LV）10010风疹（RUV）30030腮腺炎10010EBV病毒10010孕妇4004025ppt课件众多的荣誉第一个国产第三代第一个国产第三代HIVHIV检测试剂检测试剂26ppt课件正在申报正在申报CE认证认证27ppt课件单位名称单位名称标本总量标本总量假阳性数量假阳性数量假阳性率假阳性率海南血液中心海南血液中心50600541北京血液中心北京血液中心2570002060.8安徽血液中心安徽血液中心29500301江西血液中心江西血液中心21733130.5河南血液中心河南血液中心827251241.5湖北血液中心湖北血液中心1200001080.9其他中心血站其他中心血站410886

9、4281总计总计31家家9724449630.92007年全年部分客户使用情况年全年部分客户使用情况28ppt课件29首家推出第四代首家推出第四代HIV试剂试剂HIV-Ab与与HIV-Ag双系统检测双系统检测 HIV-Ag和和HIV P24抗体共同包被抗体共同包被 双抗原夹心法检测双抗原夹心法检测HIV-Ab 双抗体夹心法检测双抗体夹心法检测HIV-Ag生物素生物素-亲和素反应系统应用亲和素反应系统应用 包被抗体生物素标记抗体包被抗体生物素标记抗体HRP标记亲和素标记亲和素29ppt课件30临床考核临床考核30ppt课件31临床考核汇总临床考核汇总研究考核汇总研究考核汇总：n 进一步缩短窗口期

10、，有效降低进一步缩短窗口期，有效降低HIVHIV传播风险传播风险 考核超过700份阳性标本（不同亚型和毒株），灵敏度100n 保证高灵敏度的同时，具备优越的特异性保证高灵敏度的同时，具备优越的特异性 考核超过15000份阴性标本（包括特殊标本），特异性99.831ppt课件32结结 论论 万泰万泰 HIV Ag/Ab诊断试剂诊断试剂全新第四代 HIV 筛查试剂为使用者提供:增强检验安全性增强检验安全性更可信赖的实验结果更可信赖的实验结果32ppt课件33我们在我们在HIV方面的研发新进展方面的研发新进展1、HIV确证试剂（RIBA试剂）与艾控中心，地坛医院等单位合作的十五攻关课题 目前已进行部

11、分临床考核2、HIV唾液尿液检测试剂（DOT-ELISA）与艾控中心，地坛医院等单位合作的十五攻关课题 目前已进行部分临床考核33ppt课件2、乙肝两对半系列试剂34ppt课件简介1全称：1、乙型肝炎病毒表面抗原（HBsAg）诊断试剂盒2、乙型肝炎病毒表面抗体（HBsAb）诊断试剂盒3、乙型肝炎病毒 E 抗原（HBeAg）诊断试剂盒4、乙型肝炎病毒 E 抗体（HBeAb）诊断试剂盒5、乙型肝炎病毒核心抗体（HBcAb）诊断试剂盒35ppt课件乙肝两对半检测原理乙肝两对半检测原理夹心法：阳性显色、阴性不显色（右）HBsAg、HBsAb、HBeAg竞争抑制法：阴性显色、阳性不显色（左）HBeAb、

12、HBcAb36ppt课件 简介简介3 3潜伏期:平均60-90 天 范围：45-180 天黄疸发生率:5 岁,10%5 岁,30%-50%急性病死率:0.5%-1%慢性感染:50次)发展中国家为主,占急性非甲非乙型肝炎 的3070%左右;临床表现类似甲肝，但不同的是：潜伏期更长,40天(1560天)；年龄较大；胆汁郁积更明显；病死率较高(15%)，孕妇(20%以上)；乙肝患者发生戊肝容易导致重症肝炎；二代病例罕见；无有效疫苗和治疗方法。戊肝是一种人兽共患病?!65ppt课件基因分型基因分型 -四型四型9 9群群 亚/非 墨西哥欧美中国/日本66ppt课件 戊型肝炎世界流行状况戊型肝炎世界流行状

13、况戊肝广泛流行于世界各地，尤其是发展中国家。Non-ABC中25%是HEV引起的。存在本土HEV RT-PCR(+)的人间病例。HEV RT-PCR(+)的猪万例以上HEV暴发区67ppt课件与人类密切接触的动物如猪、牛、羊、鼠、鸡、狗和野猴等体内陆续检出HEV抗体，以猪的感染率最高；猪、鼠体内分离的HEV与人HEV有很高的同源性；猪HEV和人HEV可成功感染猪、恒河猴和黑猩猩；以猪HEV感染过的猪肝、心、胰(静脉接种)和骨骼肌匀浆物、粪便(口服接种)再感染SPF猪，发现只有接种肝匀浆物的猪在3-7和14-20DPI出现抗体转阳和病毒血症。外环境中HEV RNA污染严重，如印度垃圾（11%）、

14、西班牙垃圾（43.5%）、美国、法国。现有垃圾处理方法只对HAV有效，但对HEV效果不大。2003年Lancet：3例食用被HEV RNA污染的鹿肉均发生急性戊型肝炎；2003年 J Gen Virol:日本在超市的猪肝中查到HEV RNA;印度（2003年8月）、江苏连云港（2003年5月）发生戊肝暴发。戊肝是一种人兽共患病戊肝是一种人兽共患病!68ppt课件万例以上的戊肝暴发万例以上的戊肝暴发年份国家.城市病例(万)孕妇病死率(%)195556印度.新德里2.910.5195556前苏联.吉尔吉斯共和国 1.118.0197374尼泊尔.加德满都山峡 1.02025197677缅甸.曼德勒

15、市 2.018.0197882印度.克什米尔 5.2NA198182尼泊尔.加德满都山峡 1.22025198688中国.新疆12.0NA198889索马里.谢贝利河下游1.1417.01991印度.坎普尔 7.9NA69ppt课件戊型肝炎肆虐日本戊型肝炎肆虐日本 感染者可能已达到感染者可能已达到650650万人万人新华网东京2002年7月23日电(记者何德功)http:/ 一向被认为只在卫生条件恶劣的发展中国家流行的戊型肝炎如今在日本已经开始一向被认为只在卫生条件恶劣的发展中国家流行的戊型肝炎如今在日本已经开始肆虐。日本国立感染研究所的全国调查表明，肆虐。日本国立感染研究所的全国调查表明，日

16、本国民每日本国民每2020个人中可能就有个人中可能就有1 1人感染戊型人感染戊型肝炎病毒肝炎病毒，而全国戊型肝炎病毒感染者可能达到，而全国戊型肝炎病毒感染者可能达到650650万人。万人。日本国立感染研究所日本国立感染研究所利用高精度抗体检查药物，抽样检查了利用高精度抗体检查药物，抽样检查了19931993年以后血库中保年以后血库中保存的血清，其中日本北部、中部和南部各存的血清，其中日本北部、中部和南部各300300人。分析结果表明，共有人。分析结果表明，共有4949人的血清存在戊人的血清存在戊型肝炎抗型肝炎抗 体，而且来自三个地区的人血清中都有感染者，这说明戊型肝炎感染范围涉及体，而且来自三

17、个地区的人血清中都有感染者，这说明戊型肝炎感染范围涉及全国各地。其中，全国各地。其中，日本中部地区感染率最高，感染率占日本中部地区感染率最高，感染率占14.1%14.1%。另据由全国另据由全国2121所国立医院、所国立医院、国立疗养所组成的肝病共同研究组调查表明，从国立疗养所组成的肝病共同研究组调查表明，从19901990年以后各医院诊断为原因不明的年以后各医院诊断为原因不明的242242位急性肝炎患者血清中，位急性肝炎患者血清中，发现发现4545人有戊型肝炎病毒，占人有戊型肝炎病毒，占18.6%18.6%。日本戊型肝炎感染途径也已初步查明。枥木县自治大学冈本宏明教授等人在本县日本戊型肝炎感染

18、途径也已初步查明。枥木县自治大学冈本宏明教授等人在本县2020个养猪场抽样检查了个养猪场抽样检查了8686头猪的血液，其中在头猪的血液，其中在3 3个养猪场发现个养猪场发现3 3头小猪有戊型肝炎病毒头小猪有戊型肝炎病毒，因，因此初步断定日本戊型肝炎为此初步断定日本戊型肝炎为“人畜共同感染症人畜共同感染症”。至于猪通过什么样的方式把病毒传染给。至于猪通过什么样的方式把病毒传染给人，现在还在研究，有关专家估计，可能是由于猪的粪便污染饮用水和食物所致。人，现在还在研究，有关专家估计，可能是由于猪的粪便污染饮用水和食物所致。感染戊型肝炎病毒之后，由于身体抵抗力强，很多人没有明显症状，或只有轻微症状，但

19、作为被感染的证据戊型肝炎抗体将终生留在体内，它可以起抑制戊型肝炎病毒增殖的作用，在戊型肝炎病毒感染者中这种隐型感染者占绝大部分。日本国立感染研究所提醒人们，戊型肝炎在日本已经大范围传染，只要有轻微症状，就要怀疑可能患有戊型肝炎，并立即采取适当治疗措施。70ppt课件戊型肝炎中国流行状况戊型肝炎中国流行状况1982年即有报道；1986-88年间新疆南部大流行：发病12万例，死亡近千人。流行率为17.2%，并有10多次水/食物型暴发报道。国家八.五攻关课题：戊肝占散发性急性肝炎的16.4%。回顾性调查上海市90年代早期1054例临床急性肝炎，戊肝占17.8%，占non-ABC肝炎的46.5%。20

20、03年卫生部公布上半年传染病疫情表明：在7种肠道传染病中除戊肝报告病例同比增长43%外，其余均在下降；戊肝病死率在各型肝炎中最高，达0.39%。71ppt课件20062006年传染病发病增加率比较年传染病发病增加率比较数据来源于2006年卫生部公布的全国法定报告传染病疫情 在发病增加率上，在发病增加率上，戊型肝炎戊型肝炎20062006年比年比20052005年同期增年同期增加加40.4%40.4%，仅次于狂犬病和艾滋病，仅次于狂犬病和艾滋病，居肠道性传染病居肠道性传染病首位。首位。72ppt课件国内发生的戊肝暴发国内发生的戊肝暴发时间时间地点地点罹患率罹患率病死率病死率(%)可能原因可能原因

21、1986.9-1988.4新疆南部三地州119280/？（?）0.6水源污染1993.2.18-3.10北京市丰台区某工厂11/107（10.3%)NA不洁饮食1994.4.27-5.15天津某部队学院24/379（6.87%)NA不洁饮食1995.2.3-3.15长春市南关区某单位11/92（12.0%）9.1会餐北京市某机关9/600（1.5%)NA2001.1.20-3.1北京市某机关145/1675 (8.7%)0.7不洁饮食2003.5连云港田湾核电站NANA不洁饮食73ppt课件HEV检测74ppt课件戊型肝炎的特异性实验诊断方法戊型肝炎的特异性实验诊断方法方法方法样品样品检测物质

22、检测物质/反应物反应物检测性能检测性能抗抗HEVHEV免疫电镜血清/血浆HEV病毒颗粒技术繁杂/价格昂贵；高度特异但灵敏度低荧光抗体阻断血清/血浆肝细胞HEV抗原、恢复期血清同上Western Blot血清/血浆重组蛋白（ORF2）ELISA血清/血浆重组蛋白、合成肽（ORF2，ORF3）HEV AgHEV Ag免疫组化肝恢复期血清同免疫电镜免疫电镜粪便恢复期血清同上HEV RNAHEV RNART-PCR血清/血浆肝和粪便HEV特异引物特异度和灵敏度好，但易污染，基因型特异引物.75ppt课件万泰公司万泰公司HEV试剂：试剂：HEV-IgG间接法间接法 HEV-IgM捕获法捕获法76ppt课

23、件HEV-IgMHEV-IgM（捕获法）图解（捕获法）图解TMB+H2O2样品样品酶标抗原酶标抗原包被抗包被抗IgMIgMTMB+H2O2样品样品酶标二抗酶标二抗底物底物包被抗原包被抗原HEV-IgGHEV-IgG（间接法）图解（间接法）图解底物底物戊肝试剂原理戊肝试剂原理77ppt课件两种抗原示意图两种抗原示意图构象型抗原（WT）线性表位抗原（GL）u 构象型抗原能自发形成多种聚合体，类似于病毒颗粒构象型抗原能自发形成多种聚合体，类似于病毒颗粒的装配过程。的装配过程。u 构象型抗原具有很强的构象依赖性表位，与构象型抗原具有很强的构象依赖性表位，与HEVHEV病毒颗病毒颗粒表面的空间结构有较大

24、相似性。粒表面的空间结构有较大相似性。u 构象型抗原免疫的单抗能够直接捕获病毒，并具有中构象型抗原免疫的单抗能够直接捕获病毒，并具有中和活性。和活性。78ppt课件E2抗原的发现及其特征抗原的发现及其特征 用大肠杆菌表达用大肠杆菌表达HEVHEV结构蛋结构蛋白白ORF2ORF2的一个片段的一个片段(E2)(E2)时时发现，该蛋白可以自发形成发现，该蛋白可以自发形成二聚体，并且二聚体蛋白对二聚体，并且二聚体蛋白对戊肝恢复期血清有极强的反戊肝恢复期血清有极强的反应性，这一反应性随着二聚应性，这一反应性随着二聚体的解聚而消失体的解聚而消失 。Western Blot(See:J Med Virol,

25、2001,64:125-132)单体二聚体SDS-PAGE79ppt课件恢复期血清NE2抗原对戊肝急性期血清和多年后的恢复期血清均有抗原对戊肝急性期血清和多年后的恢复期血清均有明显的反应，恢复期血清的反应性集中在二聚体上明显的反应，恢复期血清的反应性集中在二聚体上二聚体单体 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 N急性期血清E2抗原的发现及其特征抗原的发现及其特征80ppt课件构象性表构象性表位位线性表线性表位位81ppt课件4项国际国内专利82ppt课件唯一有实验动物模型的肝炎试剂唯一有实验动物模型的肝炎试剂83ppt课件不同戊肝试剂在急性

26、戊肝中的灵敏度不同戊肝试剂在急性戊肝中的灵敏度单位单位WT IgMGL IgMGL IgG阳性数阳性数/检检测数测数灵敏度灵敏度阳性数阳性数/检检测数测数灵敏度灵敏度阳性数阳性数/检检测数测数灵敏度灵敏度香港卫生署香港卫生署135/14096.4%112/14080.0%-复复旦旦大大学学47/4897.9%35/4872.9%45/4893.8%广广西西C D C123/12697.6%109/12686.5%-合合 计计305/31497.1%256/31481.5%45/4893.8%84ppt课件与进口试剂的比较qSee:Lin et al.J Clin Microbiol,2000,

27、38:3915-3918qGL IgG和GL IgM为新加坡一家公司的戊肝诊断试剂(间接法)qGL IgG灵敏度和特异度均不理想，漏诊和假阳性明显；qGL-IgM特异度尚佳，但灵敏度太差，漏诊严重。85ppt课件不同戊肝试剂在其它肝炎中的特异度不同戊肝试剂在其它肝炎中的特异度考核考核单位单位肝炎肝炎类型类型万泰万泰HEV-IgMHEV-IgMGL HEV-IgMGL HEV-IgM阴性数阴性数/检检测数测数特异度特异度(%)(%)阴性数阴性数/检测数检测数特异度特异度(%)香港香港卫生署卫生署HAVHAV167/168167/16899.499.4-HBVHBV163/164163/16499

28、.499.4-HCVHCV164/168164/16897.697.6-复旦复旦大学大学HAVHAV285/298285/29897.397.3233/298233/29878.2%86ppt课件87ppt课件小结小结灵敏度：WT IgM（97.1%）GL IgG（93.8%）GL IgM（81.5%）；特异度：WT IgM（98.6%）GL IgM（96.7%）GL IgG（85.4%）；在甲、乙和丙型肝炎中，WT IgM的特异度在97.6%以上；而GL IgM在甲型肝炎中的特异度仅为78.2%；综合评价认为：指标指标灵敏度灵敏度特异度特异度WT IgM佳佳佳佳GL IgM差差尚可，但在甲肝

29、中可出现较多假阳尚可，但在甲肝中可出现较多假阳性，在甲肝流行区问题严重。性，在甲肝流行区问题严重。GL IgG尚可尚可差，差，较多假阳性较多假阳性88ppt课件6、胶体金系列89ppt课件试纸条的结构及制造工艺试纸条的结构及制造工艺WT1234567881.塑料底衬塑料底衬2.黏合剂黏合剂3.硝酸纤维素膜硝酸纤维素膜4.对照线对照线5.检测线检测线6.交联垫（样品垫）交联垫（样品垫）7.吸水纸吸水纸8.保护膜保护膜试纸条图解试纸条图解90ppt课件试纸条工作原理试纸条工作原理 在硝酸纤维素膜的检测线上包被有特异性抗体，对照线上包被有兔抗抗体，另一个特异性抗体在标记胶体金后干燥于硝酸纤维素膜下端

30、的玻璃纤维上。当样品由于层析原理流动时，首先溶解干燥的金标sAb单抗，特异性HBsAg抗原与其反应，在流过检测线时再和另一个单抗结合形成免疫复合物。由于包被单抗被固定在硝酸纤维素膜上，免疫复合物就被留下，逐渐形成肉眼可见的红紫色条带，此时该样品为阳性。继续流动到对照线时，金标sAb单抗和羊抗兔IgG结合显色，出现对照带。当样品中不含HBsAg特异性抗原时，标记胶体金的单抗流过对照线时也可和该处的羊抗兔抗体结合也可形成红紫色条带，导致对照线显色。WT91ppt课件胶体金试纸条的优缺点：（1）优点:(a)灵敏度适中；(b)使用方便，适于快速诊断；(c)易于存放，效期长。（2）缺点:(a)应用时间短，范围小；(b)部分项目灵敏度较低；(c)价格较贵。92ppt课件万泰提供的胶体金系列1、HBsAg2、HBV两对半3、HIV4、TP5、轮状病毒93ppt课件94谢谢！谢谢！94ppt课件