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1、5杂氮2脱氧胞苷对BGC823胃癌细胞株RIZ1基因去甲基化转录调控作 目的: 探讨5杂氮2脱氧胞苷（5AzaCdR）对人胃癌细胞系BGC823细胞株RIZ1基因的去甲基化转录调控作用及对细胞株生长增殖的影响，寻找胃癌治疗的新靶点. 方法: 使用3种不同浓度5AzaCdR干预胃癌BGC823细胞，甲基化特异性PCR（MSP）和逆转录聚合酶链反应（RTPCR）检测药物干预前后RIZ1基因的甲基化状态和RIZ1 mRNA的表达；MTT法检测细胞增殖活性，流式细胞术分析细胞周期及细胞凋亡的改变.结果: 未经5AzaCdR处理的BGC823细胞中RIZ1基因启动子区域CpG岛高甲基化，且RIZ1 mR
2、NA不表达，经2，5，10 mol/L 5AzaCdR处理48 h后，RIZ1基因启动子区域高甲基化得到逆转，细胞中均有RIZ1 mRNA表达，相对定量值分别为0.509，0.716，0.831；3种浓度5AzaCdR处理BGC823细胞后，与对照组比较，细胞增殖速度出现不同程度减慢（P0.05），随着浓度的增加其抑制作用增强；并显著抑制BGC823细胞生长周期,与对照组相比，G0/G1期细胞数增加，S期细胞数减少，细胞凋亡率明显升高（P0.05）. 结论: 5AzaCdR能有效逆转胃癌BGC823细胞RIZ1基因的异常甲基化，从而激活因高甲基化导致RIZ1基因沉默的再转录，诱导该基因的表达，
3、抑制肿瘤细胞生长.胃肿瘤 肿瘤细胞，培养的 5杂氮2脱氧胞苷 RIZ1基因 DNA甲基化0引言抑癌基因失活是胃癌发生的重要原因，多种抑癌基因由于启动子区域CpG岛高甲基化而导致其失活已得到广泛证实. DNA甲基转移酶抑制剂5杂氮2脱氧胞苷（5AzaCdR）通过抑制甲基化酶，可使多种启动子区域高甲基化的抑癌基因重新表达或表达增高1. RIZ基因（Rb interacting zinc finger gene）是Buyse等2对可与Rb结合的蛋白质进行功能性筛选时分离出的，定位于人染色体1p36. 能够产生两种交替出现的蛋白产物RIZ1和RIZ2. RIZ1基因是一种新型肿瘤抑制基因，在胃癌中对该
4、基因的研究，国内少见报道. 为研究胃癌中该基因的甲基化状态及CpG岛去甲基化后其转录活性的表达，我们应用5AzaCdR对BGC823细胞进行处理，观察RIZ1基因转录表达情况及细胞生物学特性的改变，从而为胃癌的临床治疗提供分子水平依据.1材料和方法1.1 材料人胃癌细胞株BGC823由兰州大学基础医学院病理学分子生物学实验室馈赠；RPMI1640（Gibco公司）；5AzaCdR（Sigma公司），用PBS充分溶解后配制成1 mol/L的母液，-20保存. EZ DNA MethylationGold Kit(北京天漠科技开发有限公司),AMV第1链cDNA试剂盒及PCR扩增试剂盒（上海生工生
5、物工程有限公司）；Trizol试剂（Invitrogen公司）；引物合成（大连宝生物工程有限公司），MTT及PI（Sigma公司）.1.2方法1.2.1细胞培养和干预将BGC823细胞用含100 mL/L小牛血清、100 ku/L青霉素和100 ku/L链霉素的RPMI1640培养液，在50 mL/L CO2浓度，37、湿度饱和的条件下培养. 另配制含2,5,10 mol/L 5AzaCdR的完全培养液. 取传代后24 h的细胞，分别加入含3种不同5AzaCdR浓度的完全培养液，根据实验要求，培养48,72 h后回收细胞. 对照组使用不含5AzaCdR的普通完全培养液.1.2.2MSP法检测5
6、AzaCdR干预前后BGC823细胞中RIZ1基因甲基化状态取对照组和药物干预48 h后BGC823细胞，应用饱和酚氯仿法抽提细胞基因组DNA，紫外分光光度计检测DNA纯度及含量. 取20 g DNA，参照EZ DNA MethylationGold Kit说明书对基因组DNA行亚硫酸氢盐修饰. 以亚硫酸氢盐修饰后DNA为模板，使用甲基化扩增试剂盒分别用甲基化引物和非甲基化引物进行PCR扩增，所有PCR扩增均使用25 L反应体系. 引物参考文献3，甲基化引物：上游5GTG GTG GTT ATT GGG CGA CGG C3，下游：5GCT ATT TCG CCG ACC CCG ACG3，扩
7、增片段为177 bp，PCR反应条件：95变性10 min，94变性30 s，68退火45 s，72延伸60 s，共40个循环后，72延伸6 min； 非甲基化引物：上游5TGG TGG TTA TTG GGT GAT GGT3，下游5ACT ATT TCA CCA ACC CCA AGA3，扩增片段为175 bp, PCR反应条件：95变性10 min，94变性30 s，60退火45 s，72延伸60 s，共40个循环后，72延伸6 min. PCR扩增产物于15 g/L琼脂糖凝胶电泳，呈像观察.1.2.3两步法RTPCR检测5AzaCdR干预前后BGC823细胞中RIZ1基因的表达取对照组
8、和药物干预48 h后BGC823细胞，用Trizol试剂提取细胞总RNA，参照AMV第1链cDNA试剂盒说明书操作合成cDNA，以Oligo dT为引物反转录. RIZ1特异引物进行PCR扩增，以GAPDH作为内参照. RIZ1引物由Oligo5.0软件设计：上游5AAG GGG AAG CAG ATG ATG TG3，下游5TGG TCC GCC TCT TAA ACC TA3，扩增片段为576 bp；GAPDH引物：上游5TTC TCC CCA TTC CGT CTT CC 3，下游5GTA CAT GGT ATT CAC CAC CC3，扩增片段为435 bp. RIZ1引物序列与GAP
9、DH引物序列PCR反应条件相同：94变性5 min，95变性30 s，52退火30 s，72延伸60 s，共35个循环后，72延伸5 min. PCR扩增产物于15 g/L琼脂糖凝胶电泳，呈像观察.1.2.4MTT法检测5AzaCdR作用于BGC823细胞后对细胞增殖的影响取对数生长期细胞后常规消化，按每孔2107个/L种入96孔板，100 L/孔，实验组5AzaCdR的终浓度分别为2，5，10 mol/L，每组设3个复孔，对照组加等量的PBS，共接种6板，每日取出1板加入5 g/L MTT液10 L，37孵育4 h后弃去上清液，PBS洗涤2次，每孔加入二甲基亚砜（DMSO）100 L，振荡器
10、振荡10min使结晶物充分溶解后，酶标仪上测定各孔A490 nm值，计算细胞增殖抑制率(CPIR)， CPIR =(对照组A490 nm-实验组A490 nm)/对照组A490 nm100；并以A490 nm为纵坐标，时间（d）为横坐标绘制细胞生长曲线.1.2.5流式细胞仪对BGC823细胞周期和凋亡率的检测取对照组和药物干预72 h后BGC823细胞，PBS洗涤2次，将细胞密度调整为1109/L，700 mL/L预冷的乙醇-20固定24 h以上，加入Rnase A至终浓度为1 g/ L，37温育30 min，加PI至终浓度为50 mg/L，1 h内测定.统计学处理: 实验数据以 xs表示，应用SPSS13.0统计软件，对所得数据进行单因素方差分析， P0.05为有统计学意义.
5杂氮2脱氧胞苷对BGC823胃癌细胞株RIZ1基因去甲基化转录调控作
