植物基因工程导论

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1、第9章 植物基因工程 （ plant gene engineering） 植物的基因 植物基因工程原理和方法 转基因研究进展,植物分子生物学与生物工程 植物基因的结构 植物基因的表达调控 叶绿体基因组 线粒体基因组,第一章、植物的基因,第一节 植物分子生物学与生物工程,1953年是分子生物学开始的年代；1973年受次建立试管内DNA分子重组技术是基因工程的开始；1978年Mary Chilton等首次应用农杆菌Ti质粒为载体，第一次将其T-DNA上的农杆碱基因转入烟草细胞，并在植物基因组中整合表达；从80年代开始，植物分子生物学迅速发展，取得不少进展。,一、植物基因组计划及基因克隆,基因组Ge

2、nome：指一种生物的全套基因和染色体。 基因组学Genomics：对基因组进行作图、测序和分析的学科。分成两支：结构基因组学和功能基因组学。 结构基因组学：构建生物的遗传图谱、物理图谱和转录本图谱及其全序列测序。 功能基因组学：研究和评价基因功能包括生化、细胞、发育、适应等。,植物基因组计划可从根本上奠定研究植物的遗传发育进化理论的新的基础。 植物基因组计划以拟南芥和水稻最引人注目。 拟南芥计划从1989年开始，目前全序列已在网上公布。 国际水稻基因组计划（IRCP）从1991年启动。 另外一些植物的基因组计划在进行之中，如玉米、大豆、番茄、油菜、桃、苹果等。,美国国家植物基因组计划,国家植

3、物基因组计划于1997年5月启动，1998年1月工作组正式公布了国家植物基因组计划的前5年规划。国家植物基因组计划是与人类基因组工程(HGP)并行的庞大的工程。,一、NPGI的内容、目标及进展NPGI的研究内容分为三部分： 第一，结构基因组研究(Structural Genomics)，即研究基因组的结构和组织； 第二，功能基因组研究(Functional Genomics)，即鉴别基因组序列的作用，研究基因组结构和组织与植物功能在细胞、有机体和进化上的关系； 第三，将基因组的信息和知识用于开发改良植物和以植物为基础的新型产品。联邦政府主要侧重于第一和第二部分的研究，第三部分的应用研究主要由私

4、人部门承担。NPGI的长期目标是了解那些对农业、环境、能源和健康具有重要意义的植物基因的结构和功能，并应用这些知识来改善人类社会。,1、拟南芥和水稻基因组测序,2、结构基因组研究结构基因组研究旨在绘出包括玉米、大豆、小麦、大麦、高粱、水稻、棉花、西红柿和松树等1012种具有经济价值的关键植物的基因图谱。为了寻找在经济作物中缺少的或没有表达的有用基因，少数非经济植物也在考虑之列。截至1999年8月，已有玉米、水稻、西红柿和大豆等13种植物的基因组草图被保存在由美国国立医学图书馆管理的基因库(GeneBank)中。,3、功能基因组研究,4、技术开发基因组结构及其对生理功能影响的新的分析方法、成本低

5、效益高的测序技术、特定条件下基因总表达方式的分析工具等。DNA芯片/微阵列是一种很有希望的技术，它用于同时分析几千种基因的表达方式，以及迅速鉴别基因功能。诸如新型绘图方法、成像系统、特定基因标记方法等新技术正在开发中。 5、基因组数据和资源的分发和使用NPGI产生的大量图谱和数据必须分发用于分析。植物基因组研究的专用工具和数据库与人类基因组工程一样，向社会开放。所有的大型植物基因研究中心都有公共的网站公布研究结果。植物基因组的数据与其他基因组的数据相整合。 6、推广与培训,拟南芥Arabidopsis thaliana 植物界的“果蝇”,拟南芥是一种十字花科植物，广泛用于植物遗传学、发育生物学

6、和分子生物学的研究，已成为一种典型的模式植物。,Small genome (114.5 Mb/125 Mb total) has been sequenced in the year 2000. Extensive genetic and physical maps of all 5 chromosomes. A rapid life cycle (about 6 weeks from germination to mature seed). Prolific seed production and easy cultivation in restricted space. Efficient

7、 transformation methods utilizing Agrobacterium tumefaciens. A large number of mutant lines and genomic resources. Multinational research community of academic, government and industry laboratories.,二、植物发育的分子生物学研究,遗传发育进化的研究将成为理论生物学关注的中心问题。如： 花发育的分子机理ABC模型 胚胎发育的分子机理 受精作用 根的发育 激素及各种信号分子对发育的影响等,三、物质代谢过

8、程的分子生物学,光合作用机理 生物固氮（固氮酶） 初生代谢调控 次生代谢调控,四、生物中心法则的有关理论问题,DNA复制、转录、翻译及转录后、翻译后的加工 转基因中外源基因和宿主核基因组之间的关系 转基因中的共抑制现象（外源基因转入后抑制同源序列的功能，涉及转录及转录后阻滞）和基因沉默（所转基因不表达，并不是丢失或突变，而是失活）,五、植物抗性分子生物学,对生物因子（病毒、细菌、真菌、虫等）和非生物因子（旱涝、冷热、盐碱、重金属等）的抗逆机制 抗逆基因的结构、功能和分化 抗逆信号传导 提高抗逆的技术等,六、植物基因转化技术,植物基因转化技术于70年代建立，是研究基因表达调控和应用基因工程改良植

9、物品种的基础技术。 转化受体的选择 转化载体的构建 适合于单子叶植物的转化系统构建 转化技术,七、植物生物技术应用,提高抗性 改良品质和提高产量 生物反应器 植物病毒分子生物学 植物分子遗传与分子进化 环境保护的分子生物学等,第二节 植物的基因,基因的分子生物学定义：产生一条多肽链或功能RNA所必需的全部核苷酸序列。 高等植物的核编码基因与其他真核生物的 基因结构类似。 高等植物的主要基因类型有：器官与组织专一性表达的基因和受环境因素诱导而表达的基因。,一、器官与组织专一性表达的基因,1、营养器官 如：rbcS基因编码Rubisco小亚基，在叶肉细胞、保卫细胞、绿色组织的细胞中表达； HRGP

10、基因编码富含羟脯氨酸的糖蛋白（胞壁主要成分），在茎的栅栏细胞、表皮细胞中表达； Sam-1基因编码S-腺苷酰甲硫氨酸合成酶，参与多胺和乙烯合成。主要在维管组织的木质部、韧皮部、厚壁组织与根的皮层中表达。,2、生殖器官中,P2基因编码参与花粉管萌发与生长时果胶解聚作用的蛋白质，在雄蕊的成熟花粉（管）中表达； Def基因编码转录因子，发生突变造成雄性器官转换成雌性器官，只在雌蕊中表达； PAL2基因编码苯丙氨酸解氨酶，参与花色素合成，只在花瓣中表达；,3、种子中,Cy4基因编码大豆贮藏蛋白，只在胚乳中表达； 02基因编码玉米的转录因子，调节玉米醇溶蛋白基因表达，只在玉米胚乳中表达； aAmyl基因

11、编码禾谷类淀粉酶，在种子吸水萌发时在糊粉层中表达；,二、受环境因素诱导而表达的基因,热休克基因 低温诱导的基因 水涝诱导基因 脱水诱导基因 创伤诱导基因 病菌感染诱导基因,三、植物编码基因的结构,高等植物的编码基因主要包括以下四个区域： 5上游区 5非翻译区 编码区 3非翻译区,A、 5上游区,指基因转录起始点5上游包括启动子在内的一段很长的区域。其中包括与基因转录起始与表达调控有关的许多元件。特点： 在起始点附近具有一致顺序：CTCATCA 在转录起始点上游（327bp处）有TATAbox，顺序为TCACTATATAG的，在其上游-75bp附近还有CAATbox，顺序为GC（T/C）CAAT

12、CT。TATAbox对RNA聚合酶准确进行起始转录是必需的，CAATbox有增强基因转录的功能。 还含调控元件，有增强或阻遏表达的；有决定基因在特定时空表达顺序的；有对激素或外界胁迫有应答作用的顺序。由于他们与基因位于同一条DNA链上，又称顺式作用元件（cis-acting elements）。,B、5非翻译区,基因的转录起始位点到翻译起始密码子之间的一段序列。 该区的5端是前体mRNA加帽（7-甲基鸟嘌呤核苷）的位点。 有些基因该区还有一些茎环结构，它们与翻译密码子的旁邻顺序对翻译的效率有影响。 有些植物在此区还有内含子，有增强基因表达的作用。,C、编码区,从翻译起始密码到终止密码子之间的一

13、段区域，或这一区域中所有外显子成分。特点： 大部分植物基因以5端的第一个AUG作为翻译起始密码子； 外显子4种核苷酸的比例：单子叶AU约43%，双子叶54%；主要差别在密码子的第三个碱基上，单子叶偏向于选择A和U。 编码区常含内含子，有些可增强基因表达；,D、3非翻译区,指转录本终止密码子后面的一段顺序。其中有一些调控元件，对mRNA的稳定性和翻译效率起重要调节作用。 在mRNA末端有12个加polyA信号，多数植物基因为AAUAAA。,5,3,AGGA或CAAT box,TATA box,加帽位点,加尾信号,A,B,信号肽序列,翻译起始,翻译终止,1,2,3,外显子,内含子,第三节 植物基因

14、的表达调控,植物基因表达的调控可在三个水平上进行：转录水平、转录后加工和翻译水平。,一、转录水平的调控,指从DNA在聚合酶作用下合成前体mRNA这一过程中的调节。主要从以下5个方面进行： 1、染色质的结构 压缩与松散、解开 2、DNA甲基化 3、转录起始复合物 4、顺式作用元件 5、反式作用因子,反式作用因子,在基因转录中，除转录起始复合物外，还有许多核蛋白起着重要调节作用，它们与相应的顺式作用元件相互作用以增强或阻遏基因的表达，或决定着基因表达的组织与发育阶段专一性。这类核蛋白称为反式作用因子，或转录因子。,二、转录后加工,编码蛋白质的核基因转录成前体RNA（hnRNA）后，要经过5端加帽

15、（mTG）与3端加尾（polyA），同时将内含子剪切掉，才形成成熟 的mRNA。 内含子的剪接是有剪接体参与完成的，它由多种小分子的核糖核蛋白颗粒组成。剪接位点多是内含子两端的GU（GU 和AG）。各种因素可影响剪接体正确正常地剪除内含子。,三、翻译水平的调节,遗传信息从mRNA翻译成多肽大致可分为起始、延伸和终止三个阶段。一些蛋白因子与tRNA的浓度影响上述阶段。 5翻译区的茎环结构影响翻译的速率，mRNA的polyA在翻译上起重要作用。 mRNA的稳定性（具帽、具尾的完整结构的保持）也是影响表达的因素之一。,第四节 叶绿体基因组和线粒体基因组,高等植物除具有核基因组外，还存在两种半自主性器

16、官叶绿体和线粒体。它们具有基因组，和核基因组一起共同调控植物的生长发育。,一、叶绿体基因组及其编码的基因,叶绿体遗传物质的研究始于1909年Bear等人对高等植物花斑病的研究；1962年Ris等首次证实叶绿体中存在着DNA；1975年第一次得到纯化的完整的叶绿体基因组（ctDNA）；1976年建立了玉米的ctDNA物理图谱；以后对ctDNA的多种RNA和蛋白质基因进行了定位。,1、叶绿体基因组,大部分植物的ctDNA分子在120160kb之间，最小的是绿藻Codium frasile，只有8kb；最大的是巨大绿藻，约2000kb。 ctDNA的显著特点是含反向重复序列IR（Inverted R

17、epeat），它把ctDNA分成大单拷贝区LSC（1085kb）和小单拷贝区SSC（1020kb）。另一特点是：具相同或相关功能的质体基因聚于同一操纵子组成复合操纵子，分布于ctDNA上。,2、cpDNA所含的基因,控制遗传的基因 光系统基因 ndh 基因,3、cp 基因的表达调控,受核基因的调控 光调控 细胞分化调控,4、cp遗传工程,将C3植物改造成C4植物 将非豆科植物转化成固氮植物 叶绿体发育机理、光合作用机理等研究 提高光合效率、开发次生代谢产物 叶绿体转化,二、线粒体基因组,线粒体基因组也叫线粒体DNA（mtDNA），大小在2002500kb之间。高等植物mtDNA在ATP产生、光

18、呼吸和氨基酸碳骨架形成中有重要作用。其环状DNA分子由主环和含有直接或倒置重复的小环组成。,mtDNA所含的主要基因,RNA 基因 rRNA基因（rDNA） tRNA基因（tDNA） 蛋白质基因 r蛋白基因 细胞色素氧化酶基因 ATP合成酶基因 阴离子通道蛋白基因 ndh1，2，3，4，5（NADH去氢酶亚基的基因）,线粒体基因组除了这个高分子的主基因组外，某些植物的线粒体还含有较小的线性或环性DNA分子。在某些植物中还检测到小的环状的隐形质粒。这些小的DNA分子有或无同细胞质雄性不育（CMS）存在相关性。,第二章 植物基因工程原理和方法,植物基因工程发展简史 植物基因工程的技术环节 目的基因

19、分离和鉴定 基因的修饰及植物表达载体的构建 受体的选择和遗传转化 基因工程细胞和植株的筛选和鉴定,第一节 植物基因工程发展简史,自1983年首次获得转基因烟草、马铃薯以来，短短十余年间，植物基因工程的研究和开发进展十分迅速。国际上获得转基因植株的植物已达100种以上，包括水稻、玉米、马铃薯等作物；棉花、大豆、油菜、亚麻、向日葵等经济作物；番茄、黄瓜、芥菜、甘蓝、花椰菜、胡萝卜、茄子、生菜、芹菜等蔬菜作物；苜蓿、白三叶草等牧草；苹果、核桃、李、木瓜、甜瓜、草莓等瓜果；矮牵牛、菊花、香石竹、伽蓝菜等花卉；以及杨树等造林树种。应该说转基因植物研究取得了令人鼓舞的突破性进展。,20世纪70年代末80年

20、代初，随着土壤根癌农杆菌侵染植物细胞后能将其Ti质粒上的T-DNA插入到被侵染细胞的基因组，并能稳定遗传给后代，植物遗传转化技术随之得到迅速发展，为植物基因工程的发展创造了条件。 植物的组织培养技术，如原生质体的培养和成株、细胞融合等技术的迅速发展，进一步促进了植物基因工程的发展。,第二节 植物基因工程原理和方法,将外源基因通过体外重组后导入受体细胞内，使这个基因能在受体细胞内复制、转录、翻译表达的操作叫做基因工程。 完整的基因工程包括基因的分离、重组、转移；基因在受体细胞中的保持、转录、翻译表达等全过程。 基因工程又称重组DNA技术，其实施至少要四个必要的条件：工具酶、基因、载体、受体细胞。

21、,一、基因工程的工具酶,基因工程中的工具酶依用途分： 限制性内切酶 如DNA限制性内切酶和甲基化酶，通过切割DNA分子，对含有特定基因的片段进行分离、分析 连接酶 如T4DNA连接酶， 将两段甚至数段DNA片段连接起来 修饰酶 如DNA聚合酶、反转录酶、碱性磷酸酶等，用于DNA分子的体外合成、体外突变、序列分析、修复等。,二、目的基因分离和鉴定,1、目的基因性质 抗病毒、细菌和真菌 杀死害虫或供害虫拒食 抵抗各种除草剂 抵抗逆境 提高植物体中蛋白质或其它物质的含量或品质,2、目的基因来源,来自于植物本身 来自动物和微生物 人工合成,3、分离技术,对已知序列进行分子克隆 从蛋白质到基因序列 PC

22、R扩增 构建cDNA文库 构建基因组文库 根据植株或细胞的表型变异进行基因分离 转座子示踪技术 基因挽救技术 基因组相减 cDNA差异显示和差式分析 与已知基因紧密连锁基因的分离 染色体步查,这类技术主要通过生物化学和病理学研究分离鉴定有关基因的蛋白产物，并对蛋白质氨基酸顺序进行分析，推断出编码该蛋白质的基因序列，然后通过抗体、寡聚核苷酸探针或PCR制备的探针对文库进行筛选来分离目的基因。 如植物抗病虫基因工程中常用的苏云金杆菌杀虫晶体蛋白基因（Bt基因）、豇豆胰蛋白酶抑制基因（CpTI基因）、病毒外壳蛋白基因（CP基因）等。,1、通过已知基因产物的分析和鉴定,（1）基因标签法。该法是利用转座

23、子或T-DNA插入植物的基因组中引起某一基因失活产生一些突变体，然后用相应转座子或T-DNA对突变体文库进行筛选，以选到的阳性克隆片段为探针，再筛选野生型植物基因文库分离目的基因。,2、通过遗传表型分析,（2）激发子的寄主受体基因克隆技术,该技术是利用病菌无毒基因（avrgene）编码的激发子与寄主抗病基因编码的受体之间存在亲和的互作关系，以病原激发子蛋白为线索分离和克隆出一些几丁质抗病基因，如番茄与无毒基因avr9对应的抗病基因cf9，与avrPto对应的抗病基因pto；拟南芥菜与avrRPS2对应的抗病基因rpS2等。,3.从研究缺失突变体的表型着手分离基因,4、以图谱为基础的定位克隆技术

24、,5、从大的基因组区域直接分离编码序列,6.应用DNA芯片技术筛选新基因,三、植物表达载体构建,目的基因被分离后，往往需要经过修饰才能应用于植物基因工程。构建植物表达载体就是：在目的基因的5端加上启动子，在基因的3端加上终止子，以便使外源基因能在植物中有效表达，充分发挥其功能。,四、受体的遗传转化,遗传转化：通过某种途径（生物或物化手段）将外源基因导入受体基因组中，并使之在受体细胞内实现功能表达。 植物细胞遗传转化：利用离体培养的植物组织、细胞及原生质体作为受体，通过某种途径和技术将外源基因导入植物细胞，获得能使外源基因稳定表达的转基因植株的技术。,1、植物基因转化的受体,整体植株水平 幼苗：

25、如农杆菌感染整株幼苗； 种质细胞系（germ line transformation）：受精卵、子房、幼穗和种子胚。 优缺点：避免使用组培技术，无需诱导植株再生过程，由感染部位长出的新枝开花结实得到转化的后代。对难以组培或再生植株困难的植物具有很大吸引力。但除拟南芥外，其它植物无成功报道。,非整株水平,叶圆片 原生质体 悬浮细胞 胚性愈伤组织 胚状体 小孢子 其它：如子叶、胚轴、茎段、根等。,2、基因转化的方法,外源基因直接导入（物化方法） 农杆菌介导的转化（生物法）,植物细胞遗传转化技术,五、基因工程细胞和植株的筛选和鉴定,为了有效地选择转化细胞，植物细胞遗传转化中常用选择标记和报告基因。,

26、1、选择标记,选择标记的要求： 能抑制植物细胞的正常生长，但并不杀死植物细胞； 有简便的方法可以检测其在转化细胞或植株中的表达。 即使在选择压力下，也不是所以存活的细胞或再生植株都是转化了的，总会有一些逃避过选择。,常用的选择标记基因,2、报告基因,一种理想的报告基因应具有以下特征：,在植物中的本底很低或没有 其产物对代谢没有不利影响 表达产物有适度的稳定性以利于检测 测定方法应简单、灵敏，可以定量 事实上，现用的报告基因中还没有可满足上述全部条件的。许多抗生素选择标记基因可作报告基因，如npt、cat等。,常用报告基因,3、转基因植株鉴定,抗性标记和报告基因进行快速鉴定 分子生物学检测 So

27、uthern Blot Northern Blot Western Blot PCR 生物学鉴定,第三章 转基因植物研究进展,转基因植物是指利用培养的植物组织、细胞或原生质体作为受体，通过某种途径或技术将外来基因（可以是重组DNA，也可以是天然基因）整合到植物细胞的染色体上，成为宿主基因组的一部分，使之稳定的表达，并可稳定遗传到后代的植物。,一、植物转基因的目的：,以某一植物种的优良的栽培品种或有希望推广应用的品种作起始材料，针对其某一缺点或不足之处转进一个或几个控制特定性状的目的基因（抗虫，抗病，抗除草剂基因），使转基因植物既保留原有的各种优良的农艺性状，同时又增加一个或几个新的目的基因控制

28、的性状。,二、转基因植物研究概况,植物转基因研究起始于70年代末和80年代初，首例转基因植物于1983年在烟草和马铃薯上获得成功，至2002年底，现有230余种植物转基因已获成功。,1、提高抗性：抗虫、抗病、抗除草剂、抗盐碱、 抗衰老、抗热及抗冷冻等。,2、 改良作物品质：改变蛋白质、碳水化合物、油脂组分、维生素、矿物元素含量等。,3、其它：雄性不育、改变花形、花色、花期、 延长保鲜期以及把转基因植物作为生物反应器生产药用蛋白及生物聚合体等方面的应用研究发展十分迅速，技术上日趋完善。,主要应用领域,三、转基因技术（方法）,1、农杆菌介导的基因转化（Agrobacterium-mediated

29、transformation）。,2、以原生质体或悬浮培养细胞或胚性细胞团块作为受体的直接基因转化(Direct gene transformation)。,3、种质系统的基因转化(Germ line transformation):利用子房、幼穗、种胚注射外源基因，DNA溶液浸泡萌动的种胚以及刚受精的花粉管通道途径向刚启动分裂的合子胚导入外源基因。,新技术的产生,1、农杆菌结合基因枪法,2、农杆菌结合真空渗透法,3、农杆菌结合局部酶解法,4、农杆菌结合超声法,5、农杆菌结合低能离子束法,HSAE（Heat shock auto-excision）载体的构建,转HSAE烟草热激与否的GUS染色：左为WT,中为热激后,右为未热激,转HSAE烟草热激与否在卡纳霉素100mg/L培养基上生长情况，左为未热激，右为热激后15d,转HSAE烟草 热激前后PCR分析. 1,2为2号株系热激前后;3,4为3号株系热激前后;5,6为8号株系热激前后;7,8为10号株系热激前后,WT为野生型热激后,左右Marker均为 DL2000,1000bp,M 1 2 3 4 5 6 7 8 WT M,