医学生物化学课件--02

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1、第二章 酶,第一节 酶的分子结构与功能 第二节 酶促反应的特点和机制 第三节 酶促反应动力学 第四节 酶的调节 第五节 多酶体系 第六节 酶的分类与命名 第七节 酶与医学的关系,酶的研究历史 1878年，Kuhne提出Enzyme. 1897年，德国科学家Hans Buchner和Eduard Buchner 成功地用不含细胞的酵母提取液实现了发酵. 1926年，美国生化学家Sumner第一次从刀豆分离到脲酶结晶，提出酶是蛋白质. 1978年，Altman提出RNA有催化功能. 1982年，Cech证实RNA有催化功能.,酶（enzyme）是由活细胞合成的，对其特异底物（substrate）起

2、高效催化作用的蛋白质，是机体内催化各种代谢反应最主要的催化剂。 核酶（ribozyme）是具有高效、特异催化作用的核酸，主要作用参与RNA的剪接。,催化反应的原理 一个化学反应体系中的各个分子所含的能量高低不同，只有那些具有较高能量、处于活化态的活化分子才能在分子碰撞中发生化学反应。反应物中活化分子越多，反应速度越快。 活化分子比一般分子高出一定的能量称为活化能：在一定温度下1摩尔底物全部进入活化态所需要的自由能（kJ/mol）。 催化剂能瞬时地与反应物结合成过渡态，因而降低了反应所需的活化能。,第一节 酶的分子结构与功能,化学反应速率依赖三个因素：碰撞频率、能量因素、概率因素,从初态转化为过

3、渡态需要能量，即为活化能（Energy of activation，EACT），形成过渡态所需的活化能越大，中间产物越难形成，反应越难进行。,一、 酶的分子组成,酶的化学本质就是蛋白质。 单纯酶（simple enzyme）：仅由氨基酸残基构成的酶 ，如脲酶，淀粉酶，脂酶。 结合酶（conjugated enzyme）： 酶蛋白（apoenzyme）+辅助因子（cofactor）。辅助因子是金属离子或小分子有机化合物。 辅酶（coenzyme）非共价键与酶蛋白疏松结合,可用透析、超滤分离 辅基（prosthetic group）：共价键与酶蛋白牢固结合，不易分离。 金属离子多为酶的辅基，小分子

4、有机化合物有的属辅酶，有的属辅基。 酶蛋白与辅助因子结合形成的复合物称为全酶，只有全酶有催化作用。,1、金属离子的作用:,金属酶（metalloenzyme）：金属离子与酶蛋白结合紧密，成为酶结构中不可缺少的组成成分。如碳酸酐酶含Zn；谷胱甘肽过氧化物酶含硒；碱性磷酸酶含Zn，羧肽酶A含Zn。 金属激活酶（metal activated enzyme）：金属离子与酶结合疏松，但需金属离子活化，故金属实际上是酶的激活剂。如激酶需Mg和Mn。 有的酶类兼含有机辅基和金属。如琥珀酸脱氢酶含黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)和Fe。,金属离子能与酶、底物形成各种形式的三元络合物，保证了酶与底物的正确定向结合

5、，而且还可作为催化基团。 Fe、Cu及Mo等金属离子可以通过氧化还原而传递电子完成多种物质的氧化还原。如铁卟啉是很多血红素蛋白的辅基。,2、小分子有机化合物： 小分子有机化合物主要参与酶的催化过程，在反应中传递电子、质子或一些基团，多为维生素。 维生素：维持细胞正常功能所必需，但需要量很少，动物体内不能合成，必须由食物供给的一类有机化合物。 水溶性维生素：VB1、VB2、Vpp、VB6、VC、VB12、泛酸、叶酸、肌醇 脂溶性维生素：VA、VD、VE、VK,酶的种类： 单体酶（monomeric enzyme）：只有一条多肽链构成的酶。 寡聚酶（oligomeric enzyme）：由多个相同

6、或不同亚基以非共价键连接的酶。 多酶体系（multienzyme system）：细胞内存在着许多由几种不同功能的酶彼此聚合形成的多酶复合物。 多功能酶（multifunctional enzyme）：一些多酶体系在进化过程中由于基因的融合，形成由一条多肽链组成却具有多种不同催化功能的酶。,第二节 酶促反应的特点和机制,一、酶促反应的特点 1、酶促反应具有极高的催化效率 酶促反应速度比非催化反应高1081020倍，比一般催 化反应高1071013。,从初态转化为过渡态需要能量，即为活化能（Energy of activation，EACT），活化能越大，中间产物越难形成，反应越难进行。,降低活

7、化能、升高温度可以加速化学反应。酶的催化作用有赖于降低反应的活化能。活化能稍有降低，速度会显著增大。,有效碰撞百分数=e-Eact/RT,活化能,2、酶促反应有高度的特异性或专一性（specificity） 一种酶只能作用于某一类或某一种特定的物质。 底物专一性 1、结构专一性： （1）绝对专一性：只作用于一个底物。与底物结构类似 的化合物只能成为竞争性抑制剂或无影响。 （2）相对专一性：作用对象不只一种底物，要求略低一 些。可分： （1）基团专一性：对键两端的基团要求程度不同， 一个要求严，另一个不严； （2）键专一性：只作用于键，对键两端的基团无严 格要求。,2、立体异构专一性： 底物的立

8、体构型影响酶和底物的结合与催化。 （1）旋光异构专一性：当底物具有旋光异构体时，酶只 作用于其中的一种。如精氨酸酶只能催化L-精氨酸水解,对D-精氨酸则无作用,这种立体异构专一性是由于酶活性中心与相应底物的结合必须是二者在构型或构象上彼此匹配才能建立。 （2）几何异构专一性：当底物具有顺反几何异构体时， 酶只作用于其中的一种。,延胡索酸(反丁烯二酸),L(+)苹果酸,酶作用专一性的假说 1、锁与钥匙学说：Emil Fisher提出，认为底物分子或其中的部分专一地楔入到酶的活性中心部位，即底物分子的化学部位与酶分子催化基团间有紧密互补的关系。,2、三点附着学说：认为立体对映的一对底物虽然基团相同

9、，但空间排列不同，这样就存在这些基团与酶分子活性中心的结合基团是否匹配的问题，只有三点都互补匹配时，酶才作用于这个底物。,3、诱导楔合学说： Koshland提出，认为当酶分子与底物分子接近时，酶蛋白受底物分子的诱导，其构象发生有利于底物结合的变化，酶与底物在此基础上互补楔合，进行反应。,3、酶易失活 凡易使蛋白质变性的因素都能使酶失去催化活性。 4、酶的活性调控 有抑制调控、共价修饰调控、反馈调控、酶原调控、激素调控等。 5、 催化活力与辅酶、辅基、及金属离子有关。,二、酶的活性中心（active center）,（一）概念： 1、对于不需要辅酶的酶来说，活性中心就是酶分子在三维结构上比较靠

10、近的少数几个氨基酸残基或是这些残基上的某些基团，它们在一级结构上可能相距甚远，甚至位于不同的肽链上，通过肽链的盘绕，折叠而在空间构象上相互靠近； 2、对于需要辅酶的酶来说，辅酶分子或其某一部分往往就是活性中心的组成部分。,（二）功能部位： 活性中心有两个功能部位： 1、结合部位：一定的底物靠此部位结合到酶分子上； 2、催化部位：底物的键在此部位被打断或形成新的键， 从而发生一定的化学变化。,（三）酶活性中心的特点： 1、活性部位在酶分子的总体中只占相当小的部分：往往只由几个氨基酸残基组成（p.384，表10-1）； 2、酶的活性部位是一个三维实体：活性部位的三维结构是由酶的一级结构所决定的。活

11、性部位的氨基酸残基在一级结构上可能相距甚远，但在肽链的盘绕、折叠而在空间结构上相互靠近； 3、酶活性部位的诱导契合：酶的活性部位并不是和底物的形状正好互补的，而是在酶和底物结合过程中，底物分子或/和酶分子构象发生一定变化后才互补的，即“诱导契合”；,4、酶活性部位是一个疏水区域：酶的活性部位是位于酶分子表面的一个裂缝内，这是相当疏水区域，非极性基团较多，产生一个微环境，提高与底物的结合能力；而其内少量的极性氨基酸残基可与底物结合而发生催化作用； 5、底物通过次级键较弱的力结合到酶上：酶与底物结合成ES复合物主要靠次级键：氢键、盐键、范德华力和疏水相互作用； 6、酶活性部位具有柔性或可运动性。,

12、三、酶促反应机制,1、趋近效应和定向效应 趋近效应：指两个反应的分子，它们反应的基团需 要互相靠近，才能反应。 酶促反应速度与底物浓度成正比。在反应系统的关键区域底物浓度增高，反应速度也增加。因此，底物与酶活性中心的靠近，提高活性中心的底物有效浓度能大大提高酶促反应速度。,定向效应: 指酶的催化基团与底物的反应基团之间的正确定 向。 除了“靠近”效率外，当底物与活性中心结合时，酶蛋白经诱导而发生构象变化，底物反应部位（基团或键）与酶的催化部位发生楔合，即“定向”作用，从而造成活性中心局部的底物浓度大大提高。,2、酶使底物分子的敏感键发生“变形”（张力），使其易断裂 底物分子受酶的作用也发生构象

13、变化，使其敏感键中的某些基团的电子云密度发生变化，产生“电子张力”而引起敏感键的一端更加敏感，发生反应（p.390，图10-3）。,3、共价催化作用 底物与酶形成一个反应活性很高的共价中间物，反应活化能由此大大降低。 酶的亲核基团（如羟基、巯基和咪唑基）对底物的亲电子中心进行攻击。亲核基团含有可提供电子的原子，向底物亲电子的原子提供电子，由此形成不稳定的共价中间物。但酶的亲核基团易变，所形成的共价中间物不稳定，在随后步骤中会被水分子或第二种底物攻击而给出所需的产物，由此可加快中间物的分解而释放出产物（p.392，图10-7）。 酶蛋白分子上的主要亲核基团：丝氨酸的羟基、半胱氨酸的巯基、组氨酸的

14、咪唑基。,4、酸碱催化作用 酶活性中心上有的基团是质子供体，有的为质子受体，均可进行催化作用。,（1）狭义酸碱催化剂：通过水分子的H+与OH-离子进行的催化。由于酶反应的最适pH接近中性，故作用不大； （2）广义酸碱催化剂：即质子供体和质子受体。在酶反应中有重要作用。 酶蛋白中起广义酸碱催化作用的功能基：氨基、羰基、羧基、硫氢基、酚羟基和咪唑基。,组氨酸的咪唑基：既是很强的亲核基团，又是有效的广义酸碱功能基。 1）其解离常数约6.0，即其解离下来的质子浓度与水中的H+相近，所以在中性条件下，有一半以酸形式存在，另一半以碱形式存在，即可作为质子供体，又可作质子受体而在酶反应中起催化作用； 2）其

15、供出和接受质子的速度十分迅速，且供出和接受的速度相等。,五、酶活性中心是低介电区域 某些酶的活性中心穴内相对是非极性的，催化基团被低介电环境包围，并排除高极性的水分子。这样，底物分子的敏感键和酶的催化基团之间就会有很大的反应力。 水会减弱极性基团间的相互作用。水的极性和形成氢键的能力很大，水的介电常数极高。这种高极性使它在离子外形成定向的溶剂层，产生自身的电场，从而大大减少了它所所包围的离子间的静电作用或氢键作用。,六、金属离子催化 （1）通过结合底物为反应定向； （2）通过可逆地改变金属离子的氧化态调节 氧化还原反应； （3）通过静电稳定或屏蔽负电荷。,四、酶催化反应机制的实例,一、溶菌酶

16、溶菌酶的生物学功能是催化细菌细胞壁多糖的水解。 这种细胞壁多糖是N-乙酰氨基葡萄糖（NAG）-N-乙酰氨基葡萄糖乳酸（NAM）的共聚物，NAG与NAM以-1,4糖苷键交替排列： 溶菌酶的最适小分子底物为NAG-NAM交替的六糖，以A，B，C，D，E，F表示，其中D是NAM。,溶菌酶分子中有一个狭长的凹穴，正适合于小分子底物的嵌合。凹穴中的Glu35和Asp52是活性中心的氨基酸残基（见下图）。,作用原理： 当酶与细胞壁接触时，与六个暴露在外的氨基糖残基结合。此时酶的构象发生变化，Glu35和Asp52相互靠近，并与底物的D糖起“靠近”和“定向”效应：Asp52羧基上的一个氧原子距离D环上的C1

17、及D环上的氧原子只有0.3nm，Glu35羧基上的一个氧原子距离D糖的糖苷键上的氧原子也只有0.3nm；同时，在酶的作用下，D糖构象也发生变形，由正常的椅式变成能量较高的半椅式或船式构象。,结合后，Glu35由于处于非极性区，呈不解离状态-COOH，这样它可以起着广义酸碱催化作用，提供一个质子给糖苷键的氧原子，使得氧原子与D环C1间的糖苷键断开，而C1带上正电荷，成为正碳原子C1+。 处于极性区的Asp52在通常情况下呈离子化状态-COO-，这样它就起着稳定C1+的作用，协调C1-O间糖苷键的断裂，直到环境中水分子的OH-与C1+结合，H+与Glu35结合，使两者恢复非离子化形式。由此完成一次

18、水解反应 。,二、胰凝乳蛋白酶 该酶的活性中心由Ser195，His57和Asp102组成，其中Ser195是酶活性中心的底物结合部位，His57是活性中心内的催化部位。在三维结构中这三个氨基酸残基是十分靠近的。 作用原理： 活性中心的Ser195、His57及Asp102构成一个氢键体系，使His57的咪唑基成为Asp102羧基及Ser195羟基间的桥梁： Ser195由于His57及Asp102的影响而成为很强的亲核基团，易于提供电子。这个氢键体系称为“电荷中继网”。,在大部分情况下，网中Asp102以离子化形式-COO-，Ser195以非离子化形式-CH2OH存在。但也有另一种情况，即由

19、于Asp102从Ser195吸引一个质子所造成，想接力赛跑那样，质子先从Ser195传递到His57上，再由His57传递到Asp102上。,在此酶促反应中，His57咪唑基起着广义酸碱催化作用：先促进Ser195的羟基亲核地附着到底物敏感肽键的羰基碳原子上，形成共价的酰化中间物，再促进酰化的ES中间物上的酰基转移到水或其他的酰基受体（如醇，氨基酸等）上。其对多肽底物水解可分两个阶段：,1、水解反应的酰化阶段： Ser195羟基的氧原子对底物敏感键的羰基碳原子进行亲核攻击，形成了一个为时暂短的四联体过渡态。在这过渡态中，底物的酰基部分与Ser195的羟基、氨基部分与His57的咪唑基相连接。在

20、此过程中，通过电荷中继网（丝氨酸向组氨酸提供质子）发生反应，敏感肽键断裂，底物中的胺成分通过氢键与His57咪唑基相连，底物的羧基部分通过酯键与Ser195的羟基相连。,2、水解反应的脱酰阶段： 首先胺从酶上释放出来，这样底物的羧基部分与酶就成了酰化酶，这是中间复合物。接着水分子进入活性中心，电荷中继网从水中吸收一个质子，结果OH-立即攻击已连在Ser195上的底物羧基碳原子，也形成一个短暂的四联体过渡态。然后His57供出一个质子到Ser195的氧原子上，结果底物中的酸成分从Ser195上释放出来，酶又恢复自由状态。,三、羧肽酶 此酶是单链蛋白质，其中紧密地结合着一个Zn2+离子。这个离子对

21、酶的活性很重要。该酶是一个外肽酶，催化肽链C-末端的肽键水解。,在酶的三维结构中，Zn2+离子处于接近酶表面的沟槽中，它与两个组氨酸（His196, 69）侧链和一个谷氨酸（Glu72）及一个水分子形成一个四面体，Zn2+离子在此四面体中与这三个氨基酸以配价键相连。,离Zn2+离子不远有一个“裂缝”（见下图），允许底物C-末端伸入。裂缝顶部还有一个口袋，可以接受C-末端的R基团，酶的Tyr248（黄）、Arg145（蓝）、Glu270 （绿）及Zn2+将底物分子适当地定位于活性中心中。,作用原理： 1、在底物诱导下，酶活性中心的结构发生巨大改变，底物的“靠近”和“定向”效应十分显著； 2、酶的

22、Glu270使底物的敏感肽键发生电子张力，使敏感肽键变得极易断裂。 底物结合的过程分五步： 1、酶侧链中Arg145上的正电荷与底物C-末端氨基酸残基上羧基的负电荷发生静电吸引作用； 2、该氨基酸残基进入酶的非极性口袋中； 3、底物敏感键上羰基中的氧与Zn2+离子相接近； 4、底物的末端氨基通过一个插入的水分子与酶中Glu270的侧链建立氢键。,构象变化结果： 1、Arg145的胍基和Glu270的羧基相向移动了0.2nm； 2、Arg145的结合，使底物末端从口袋中推走了4个水分子，并将结合在Zn2+离子上的水分子推开（但留在附近） ，底物自身结合到Zn2+离子上； 3、由于Arg145的移

23、动带动了Tyr248的羟基移动1.2nm，从酶表面移到底物肽键附近，由此关闭了活性中心的凹道，活性中心从充满水的状态转变为疏水区。,酶与底物结合后，Zn2+离子、Glu270和Tyr248的作用： （1）Zn2+离子：使敏感肽键产生电子张力。酶与底物靠近时，敏感肽键指向Zn2+离子，在该离子作用下，底物羰基碳原子的电子云密度降低，呈正电性，这样羰基碳原子在亲核攻击下更加脆弱。同时，Glu270负电荷靠近肽键加大了这种偶极矩。因此Zn2+离子对底物造成的电子张力大大地促进了底物的水解。 （2）Glu270和Tyr248： 第一种说法：Glu270首先激活水分子，使其释放出OH-，由OH-直接攻击

24、底物敏感肽键的羰基碳原子，同时Tyr248提供一个质子，由此底物的肽键直接水解； 第二种说法：Glu270直接攻击羰基碳原子，并且Tyr248向该肽键的-NH-提供一个质子，肽键断开，生成一个胺和一个Glu270与底物羰基相连的酸酐，最后水分子使酸酐水解，生成一个酸和复原的酶。,注意： （1）Tyr248参与底物与酶的结合过程，而在催化过程中仅仅是起提供质子的作用，并不是催化所必需的； （2）在羧肽酶A中，底物有末端羧基，就能与Arg145的正离子基团形成盐键，触发Tyr248移至酶活性中心。如果底物没有末端羧基，就不发生这种结合和移动，酶则不表现活性。,第三节 酶的活力,酶的活力是指其在一定

25、条件下催化某一特定反应的能力。 一、酶活力与酶反应速度 酶活力：一定条件下催化某一化学反应的反应速度。 反应速度（v）的单位：浓度/单位时间，即单位时间内单位体积中底物的减少量或产物的增加量。 产物浓度对反应时间作图，其曲线的斜率就是反应速度。反应速度只在最初一段时间内保持恒定，随反应时间延长，反应速度逐渐下降。因此研究酶反应速度应该以初速度为准（通常以底物的变化在起始浓度的5%以内的速度为初速率）。,二、酶的活力单位 1个酶活力单位：指在特定条件（温度25，pH和底物浓度等均最适）下，在1分钟内能转化1mol底物的酶量，或是转化底物中1mol的有关基团的酶量。 习惯用法：如淀粉酶，以每小时催

26、化1g可溶性淀粉液化所需的酶量为1个酶活力单位；也可以每小时催化1ml 2%可溶性淀粉液化所需的酶量表示。 三、酶的比活力 每mg酶蛋白所具有的酶活力。 单位：单位/毫克蛋白（U/mg蛋白质） 也可：单位/克 或 单位/毫升 比活力可用来比较每单位重量酶蛋白的催化活力。 四、酶的转换数kcat 为每秒钟每个酶分子转换底物的微摩尔数（mol）。相当于一旦底物-酶中间物ES形成后，酶将底物转换为产物的效率（相当于米氏方程中的k3）。,第四节 酶促反应动力学,研究酶催化反应过程与速率及各种影响酶催化速率的因素的关系. 酶促反应速度：单位时间内反应物的消耗或产物的增加（取其初速度）。,一、底物浓度的影

27、响 1、“中间产物”假说与米氏方程 在一定的酶浓度下将初速度（v）对底物浓度S作图时： 一级反应：当底物浓度较低时，反应速度与底物浓度呈正比关系； 混合级反应：随着底物浓度的增加，反应速度不再按正比升高； 零级反应：继续增大底物浓度，反应速度递增为零，这时反应速度已趋向一个极限，说明酶已被底物饱和。,解释这种现象的是“中间产物”假说：酶与底物先络合成一个络合物，它是作为过渡态物质，然后络合物进一步分解，成为产物和游离态酶。 这个假说的前提是酶与底物反应的“快速平衡”，即在反应的开始阶段，两者反应速度很快，迅速建立平衡关系。 按“稳态平衡”假说，酶促反应分两步进行： 第一步：酶（E）与底物（S）

28、作用，形成酶-底物中间产物 E+SES 第二步：中间产物分解，形成产物（P），释放出游离酶(E)： ESP+E,反应初期，V=K3ES,K3,稳态：ES生成=ES分解,K1ES=K2ES+K3ES,ES=ES/Km,E=ET-ES,ES=（ET-ES）S/Km,ES=ETS/（S+Km）,V=K3ES=K3ETS/（S+Km） =VmaxS/（S+Km）,1913年，Michaelis与Menten：米孟式方程 v=VmaxS/(S+Km) v=酶促反应的速度，Vmax=在E与ES相等时的酶促反应达到的最大速度，Km=(k2+k3)/k1,Km、Vmax意义 （1）v=1/2Vmax时，Km=

29、S。 Km不依赖于酶浓度， Km就是酶促反应速度为最大速度一半时底物浓度。 Km的单位是mol/L. （2）Vmax=K3ET，Vmax与加入的酶量成正比。 （3） Km为酶的特征常数。每种酶都有其Km值， Km只与酶的结构和酶的底物有关，与酶的浓度无关. （4） Km可表示酶与底物的亲和力。 Km越大，酶与底物的亲和力越小。 （5）一种酶催化几种底物时有不同的Km，其中Km最小的底物为该酶的天然底物或最适底物。多底物反应的酶对于不同的底物有不同的Km。 （6）酶的转换数（K3）：当酶被底物充分饱和时，单位时间内每个酶分子催化底物转变为产物的分子数。K3=Vmax/E,Km及Vmax的测定法

30、1、双倒数作图法,2、Hanes作图法,1/V,1/Vmax,-1/Km,K=Km/Vmax,1/S,-Km,S,S/V,Km/Vmax,K=1/Vmax,2、多种底物的反应 大多数酶反应包含一种以上的底物，至少是双底物反应： A+BP+Q 双底物反应的三种机理： 1) 依次反应机理： B P E+A EA EAB EPQ EQ E+Q 需要NAD+或NADH+的脱氢酶的反应属于这类型。 2) 随机机理： E+AEA B Q EPE+P EABEPQ E+BEB A P EQE+Q 3) 乒乓反应机理： A P B Q E E 转氨酶的反应属于这类型。,二、酶浓度对反应速度的影响,在酶促反应体

31、系中，当底物浓度大大超过酶的浓度，使酶被底物饱和时，反应速度与酶的浓度变化成正比关系。V=K3E。,三、温度对反应速度的影响,温度较低时，反应速度随温度升高而加快，温度超过一定数值后，酶受热变性，反应速度反而减慢，形成倒V型曲线，在此曲线顶点所代表的温度时反应速度最大，称为最适温度（optimum temperature）。 酶的最适温度不是酶的特征常数，它与反应进行的时间有关。 低温一般不使酶破坏。温度回升后，酶可以恢复活性。低温麻醉、低温保存菌种、低温保存酶制剂。 温度系数：在达到最适温度之前提高温度，可增加反应速度。反应温度提高10，其反应速度与原来的反应速度之比称为反应的温度系数（Q1

32、0）。,pH可影响酶分子尤其是活性中心上必需基团和催化基团的解离程度，也可影响底物和辅酶的解离程度，从而影响酶与底物的结合。在特定pH条件下，酶、底物和辅酶的解离情况适宜于相互结合，使酶反应速度达到最大值，这个pH称为最适pH（optimum pH ）。 动物体内多数酶的最适pH接近中性。 最适pH不是酶的特征常 数，它受底物浓度、缓 冲溶液的种类、浓度及 酶的纯度影响。,四、 pH对反应速度的影响,五、抑制剂对反应速度的影响,酶的抑制剂（inhibitor）：凡能使酶的催化活性下降而不引起酶蛋白变性的物质 1、不可逆性抑制（irreversible inhibition） 抑制剂与酶的必需基

33、团以牢固的共价键结合，从而使酶活丧失，不能用透析、超滤等去除抑制剂。 如低浓度的重金属离子Hg2+、Ag+、As3+ 可与酶分子SH结合，使酶活抑制。 又可分： （1）专一性的不可逆抑制：抑制剂仅仅和酶活性部位的 有关基团反应； （2）非专一性的不可逆抑制：抑制剂可和一类或几类基 团反应。,路易士气（砷）,巯基酶,失活的酶,重金属盐引起的巯基酶中毒可用二巯基丙醇（BAL）解毒。,BAL,农药敌百虫、敌敌畏、1059等有机磷化合物能特异地与胆碱酯酶（Choline esterase）活性中心丝氨酸残基的羟基结合，使酶失活。,+,+,R,O,P,O,O,X,R,HO,E,R,O,P,O,O,O,R

34、,E,HX,有机磷化合物,羟基酶,失活的酶,敌百虫,敌敌畏,有机磷杀虫剂,胆碱乙酰化酶,胆碱酯酶,胆碱,乙酰胆碱,乙酰胆碱为生物体内传递神经冲动的重要物质。胆碱酯酶为羟基酶，有机磷杀虫剂中毒时，此酶活受抑制，结果造成乙酰胆碱的堆积，造成神经过度兴奋直至抽搐而死。可用解磷定来治疗。,2、可逆性抑制,（1）竞争性抑制 特点 ：抑制剂与底物结构相似； 抑制剂与底物结合在酶的同一位点； 抑制作用可被高浓度的底物减低以至消除； Km增大，Vmax不变。,1/V,1/S,1/Vmax,-1/Km(1+I/Ki),竞争性抑制,无抑制剂,抑制剂,斜率=Km/Vm(1+I/Ki),丙二酸、苹果酸、草酰 乙酸为琥

35、珀酸脱氢酶的竞争性抑制剂。,Glu,PABA（对氨基苯甲酸）,喋呤,H,H,N,H,C,H,C,H,2,C,O,O,H,C,H,2,C,O,O,H,N,N,N,N,C,H,2,N,H,C,O,O,H,H,2,N,S,O,2,N,H,R,H2N,磺胺药,PABA+二氢喋呤+Glu,F,H,2,F,H,4,磺胺药与PABA结构相似，可与PABA竞争FH2合成酶的活性中心，FH2合成受抑制，FH4随之减少，使核酸合成障碍，细菌生长繁殖受到抑制。,FH2还原酶,FH2合成酶,四氢叶酸FH4,氨甲喋呤（MTX）是FH2还原酶的竞争性抑制剂，抑制人体 内FH4的合成，以致抑制肿瘤的生长。,叶酸,二氢叶酸,

36、四氢叶酸,（2）非竞争性抑制 酶可同时与底物及抑制剂结合： EI+SESI或ES+IESI， 但中间物ESI不能进一步分解为产物。 这类抑制剂是与酶活性中心以外的基团结合；,若Ki=Ki，则Vmax减小而Km不变，称非竞争性抑制。,1/V,1/S,-1/Km,(1+I/Ki)/Vmax,非竞争性抑制,3、反竞争性抑制,特点：S、I结构不相似，结合位点不同，增加S反而加强抑制， Km减小，Vmax减小。,酶只有在与底物结合后，才能与抑制剂结合：ES+IESI，而ESI不能进一步分解为产物。,1/S,1/V,(1+I/Ki)/Vmax,无I,反竞争性抑制,斜率=Km/Vm,各种类型抑制的表观Km及

37、Vmax,六、激活剂对反应速度的影响,使酶由无活性变为有活性或使酶活性增加的物质称为酶的激活剂（activator）。大多为金属离子，如Mg2+、K+、Mn2+，少数为阴离子如Cl-，也有的为有机化合物，如胆汁酸盐。 必需激活剂（essential activator）：对酶促反应不可少。与酶、底物结合参加反应。 非必需激活剂（non- essential activator）： 有些激活剂不存在时，酶仍有一定的催化活性。,第四节 酶的活性调节方式,一、别构调节 别构酶：当代谢物分子可逆地结合到酶的某一非催化部位时，可改变酶的构象，进而改变酶的活性，这种调节称别构调节，受别构调节的酶称别构酶。

38、 特点：1、常含有多个亚基（有四级结构）；2、除催化部位外，还有调节部位；3、酶分子的催化部位和调节部位有的在同一亚基上，也有的不在同一亚基上；4、不符合米氏方程，存在协同效应。 别构激活：因别构而导致酶活性增加 别构抑制：因别构而导致酶活性降低,别构酶结构：除有结合底物和起催化作用的活性中心外，还有可结合调节物的别构中心。前者负责对底物的结合和催化，后者负责调节反应速度。两个中心位于酶蛋白的不同部位上（或不同亚基上，或同一亚基不同部位上）。 1、调节物：1）同促效应：调节物是底物。酶分子 上有两个以上的底物结合 中心，调节作用取决于酶 上有多少个底物结合中心 被结合； 2）异促效应：调节物不

39、是底物，而是 其他代谢分子。,天冬氨酸转氨甲酰酶（ATCase）为例（p.413）： 底物N-氨甲酰磷酸和天冬氨酸促进ATCase活性，为同促效应；CTP为最终产物，降低了酶与底物的亲和性，抑制ATCase活性；ATP为非底物分子，但可增强酶与底物的亲和性而激活ATCase，所以起到了异促效应。,2、别构酶的性质： （1）别构酶一般是寡聚酶，通过次级键由多亚基构成：别构 酶的活性中心（活性部位）和别构中心（调节部位）可 能在同一亚基上，也可能分别在不同的亚基上；每个别 构酶分子可以有一个以上的活性部位和调节部位。 （2）别构酶的动力学：因别构酶有协同效应，所以其S对v 的动力学曲线不是双曲线，

40、而是S形曲线（正协同）或 表观双曲线（负协同）。,S形曲线：表明酶结合一分子底物（或调节物）后， 酶的构象发生变化，从而大大增加对后 续底物分子的亲和性，促进后续分子与 酶的结合，表现为正协同性，这种酶称 为具有正协同效应的别构酶； 表观双曲线：在底物浓度较低范围内酶的活力上升 很快，但随后底物浓度虽有较大的提 高，但反应速度升高却很小，表现为 负协同性，这种酶称为具有负协同效 应的别构酶。,怎么区分米氏酶与别构酶？,koshland建议用饱和比值（saturation ratio, Rs）,典型的米氏酶 RS=81,具有正协同效应的别构酶 RS81,具有负协同效应的别构酶 RS81,（3）K

41、型效应物和V型效应物：能改变底物的K0.5而不改变反应Vmax的效应物称为K型效应物；能改变Vmax而不改变K0.5的效应物称为V型效应物（p.419，图10-58）。 （4）别构酶的脱敏作用：别构酶经加热或化学试剂处理，可引起别构酶解离，失去调节活性，称为脱敏作用。脱敏后的酶表现为米氏酶的动力学双曲线（p.420，图10-59）。,4、别构模型： 1）协同模型（对称模型，WMC模型）： 特点： （1）别构酶是由确定数目的亚基组成，各亚基占有相等的地位，因此每 个别构酶都有一个对称轴； （2）每个亚基相对一种调节物只有一个结合位点； （3）每种亚基有两种构象，一种为有利于结合底物或调节物的松弛

42、型构 象（R型），另一种为不利于底物或调节物结合的紧张型构象（T 型）。这两种构象可以互变：采取同步协同方式转变（齐变方式 ），即各亚基在同一时间内均处于相同的构象状态。如果一个亚 基从T态变为R态，则其他亚基也几乎同时转变成R态； （4）当蛋白质由一构象状态转变至另一构象状态时，其分子对称性保持 不变。,2）序变模型（KNF模型）： 特点： （1）当调节物不存在时，别构酶只有一种构象存在（T），而不是处于 R=T的平衡状态，只有当调节物与之结合后才诱导T态向R态转变； （2）别构酶的构象是以序变方式进行的，而不是齐变。当调节物与一个 亚基结合后，可引起该亚基构象发生变化，并使邻近亚基易于发生

43、 同样的构象变化，即影响对下一个调节物的亲和力； （3）亚基间的相互作用可能是正协同效应，也可能是负协同效应，前者 导致下一亚基对调节物有更大的亲和力，后者则降低亲和力。,二、酶的共价修饰（covalent modification）,酶蛋白肽链上的某些残基侧链在另一组酶的催化下发生可逆的共价修饰 ，从而引起酶活性改变，调节酶的活性：磷酸化、乙酰化、甲基化、腺苷化。 磷酸化修饰：通过各种蛋白激酶的催化可使酶蛋白中丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸的羟基进行磷酸化修饰，又可通过各种蛋白磷酸酶催化使此类磷酸基团水解出来，从而形成可逆的共价修饰来改变酶的构象，调节酶的活性。,磷酸化修饰特点： 1、磷酸化及脱磷酸

44、化分别由蛋白激酶及蛋白磷酸酶催化。 2、可连锁进行，逐级磷酸化或脱磷酸化，出现级联放大。 3、磷酸化仅需以ATP供给磷酸基团，耗能远小于合成酶蛋白，作用快速。 4、磷酸化修饰常与别构调节相互协作。,三、酶原的激活,酶原（Zymogen）：有些酶（绝大多数为蛋白酶）在细胞内合成及初分泌时，没有活性 酶原的激活：在一定条件下，酶原可转化成有活性的酶。酶原激活的机制是分子内肽键一处或多处断裂，使分子构象发生一定程度改变，从而形成酶的活性中心。 酶原激活也存在级联反应。,胰蛋白酶原,肠激酶,胰蛋白酶+六肽,胰凝乳蛋白酶原,胰蛋白酶,-凝乳蛋白酶+两个二肽,羧基肽酶原,胰蛋白酶,羧 基肽酶,A+几个碎片

45、,1、胃蛋白酶原（pepsinogen）的激活,2、胰蛋白酶原（trypsinogen）的激活,3、胰凝乳蛋白酶原（chymotrypsinogen）的激活,除消化道的蛋白酶外，血液中有关凝血和纤维蛋白溶解的酶类也以酶原的形式存在，且存在级联反应。 意义：消化 道内蛋白酶以酶原的形式分泌，避免细胞产生的蛋白酶对细胞进行自身消化，并使酶在特定的部位和环境中发挥作用； 此外，酶原可视为酶的贮存形式。如凝血和纤维蛋白溶解酶类以酶原的形式在血液循环中运行，一旦需要便转化为有活性的酶。,四、激促蛋白质或抑制蛋白质的调控 某些酶结合了专一性的激促蛋白质或抑制蛋白质，从而使其活性受到调控。 例：钙调蛋白-当

46、细胞外的钙离子浓度升高时，钙离子与钙调蛋白结合，而带有结合态钙离子的钙调蛋白会结合到许多酶上，激活许多酶。,同工酶(isoenzyme),同工酶：指催化相同的化学反应，而酶蛋白的分子结构、理化性质乃至免疫学性质不同的一组酶。由不同基因或等位基因编码的多肽链所组成，或由同一基因转录生成的mRNA翻译成不同多肽链组成的蛋白质。同工酶存在 于同一种属或同一个体的不同组织或同一细胞的不同亚细胞结构中。,乳酸脱氢酶(LDH):由H或M两种亚基组成的四聚体。五种同工酶LDH1（H4）、LDH2（H3M）、LDH3（H2M2）、LDH4（HM3）、LDH5（M4），它们向正极泳动的速度由LDH1 LDH5依

47、次递减，可藉此分离。,同工酶虽然催化相同的反应，但可有不同的功能 。,心肌中含量最多的是LDH1（H4）对NAD+有较大的亲和力，易受丙酮酸抑制，它的作用主要是催化乳酸脱氢生成丙酮酸，有利于心肌利用乳酸氧化供能。 骨胳肌中含量多的LDH5，对NAD+亲和力低，不受丙酮酸的抑制，其作用是催化丙酮酸加氢生成乳酸，有利于骨胳肌生成乳酸。,第五节 多酶体系,一、概念和分类 细胞中的许多酶常在一个连续的反应链中相互联系在一起，这种由几个酶形成的反应链称为“多酶体系”。 1、可溶性类型：多酶体系中的各种酶在细胞质中以可溶性形式各自独立存在，没有结构上的联系； 2、结构化类型：多酶体系中的各种酶彼此有机地组

48、合在一起，形成多酶复合体。如丙酮酸脱氢酶复合体（p297） 3、定位于细胞器结构的类型：如呼吸链中的酶定位于线粒体的内膜上。,HSCoA,E,3,：二氢硫辛酸脱氢酶,E,2,：转乙酰化酶,E,1,：丙酮酸脱氢酶,E,3,E,2,E,1,N,A,D,+,NADH+H,+,F,A,D,H,2,F,A,D,C,H,3,C,珆,S,C,o,A,O,H,S,L,H,S,S,L,S,珆,S,L,H,S,C,H,3,C,O,C,H,3,C,T,P,P,O,H,H,T,P,P,C,O,2,C,H,3,C,C,O,O,H,O,二、自我调节 1、酶促反应序列：1）直线式；2）分枝式；3）循环式。 2、限速步骤：多

49、酶体系的总速度决定于其中反应速度最慢的一个反应，这个速度最慢的酶限制着全部反应序列的速度，称为限速步骤。大部分具有自我调节能力的多酶体系的第一步反应就是限速步骤。 3、反馈作用：第一步反应的酶被全部反应序列的最终产物或反应序列分叉处的酶被最终产物所抑制，这种过程称为反馈作用。 4、受反馈调控的酶往往是别构酶。 有的别构酶有“正调节物”，酶活性被激活（底物）； 有的别构酶有“负调节物”，酶活性被抑制（最终产物）； 有的别构酶则正负调节物兼而有之。 有的别构酶只有一个专一性的调节物，称之为单价别构酶； 有的别构酶有两个或更多的专一性调节物，称之为多价别构酶。,第六节 酶的分类与命名,一、酶的分类

50、1、氧化还原酶类 2、转移酶类 3、水解酶类 4、裂合酶类 5、异构酶类 6、合成酶类 注意顺序不能变！ 二、酶的命名 习惯命名法：底物+反应类型：乳酸脱氢酶 底物名称：蛋白酶、核糖核酸酶 来源+底物：胃蛋白酶、唾液淀粉酶,（1）标明底物，催化反应的性质 例: G-6-PF-6-P G-6-P异构酶,（2）两个底物参加反应时应同时列出，中间用冒号（:）分开。 如其中一个底物为水时，水可略去。 例1： 丙氨酸+-酮戊二酸 谷氨酸+丙酮酸 丙氨酸:-酮戊二酸氨基转移酶 例2： 脂肪+H2O 脂酸+甘油 脂肪水解酶,系统命名法：E.C(1.1.1.1) （醇 :NAD+氧化还原酶）,1编号: 用4个

51、阿拉伯数字的编号表示，数字中用“”隔开，前面冠以EC（为Enzyme Commission）。 EC 类.亚类.亚亚类.排号，如EC 1.1.1.1 Enzyme Handbook， Thomas E Barman编，Vol I, Vol II 1969年。 Enzyme Handbook，Thomas E. Barman编 Supplement I, 1974年。,系统命名法：E.C(1.1.1.1) （醇 :NAD+氧化还原酶）,（一）酶的分离纯化 1选材 2破碎细胞 3抽提 4去核酸、去多糖 5纯化 6保存 由于酶的特殊性，在提纯过程中要注意 : 1全部操作在低温04。 2在分离提纯过程

52、中，不能剧烈搅拌。 3在提纯溶剂中加一些保护剂，如少量EDTA、少量-巯基乙醇。 4在分离提纯过程中要不断测定酶活力和蛋白质浓度，从而求得比活力，还要计算总活力。,第七节 酶的分离、纯化及活力测定,总活力单位体积的酶活力(U/ml)分离溶液总体积(ml),（二）酶活力的测定,酶活力（enzyme activity, 也称酶活性） 酶活力的测定 1测定酶活力时应注意几点 （1）应测反应初速度（initial velocity or initial speed） （2）酶的反应速度一般用单位时间内产物的增加量来表示。 （3）测酶活力时应使反应温度、pH、离子强度和底物浓度等因素保持恒定。 （4）测

53、定酶反应速度时，应使SE。,2酶活力和比活力表示方式,（1）酶活力（enzyme activity） 1 IU=1 mol/min 每分钟内催化1 mol底物转化为产物所需的酶量,（2）酶的比活力（specific activity，也称比活性） 比活力：指每mg蛋白质所具有的酶活力，一般用U/mg蛋白质来表示，比活力说明酶的纯度。 比活力= 酶活力（U/ml）/蛋白质浓度（mg/ml）,（3）转换数（kat): 1 Kat=1 mol/s,Kat单位与IU单位之间的换算关系： 1 IU=1/60 Kat,3. 酶活力的测定方法,（1）分光光度法（spectrophotometry）,该法要求

54、酶的底物和产物在紫外或可见光部分光吸收不同。,优点： 简便、迅速、准确。 一个样品可多次测定，有利于动力学研究。 可检测到10-9mol/L水平的变化。,（2）荧光法（fluorometry）,该法要求酶反应的底物或产物有荧光变化。 主要的优点：灵敏度很高，可以检测10-12mol/L的样品。 酶蛋白分子中的Tyr、Trp、Phe残基以及一些辅酶、辅基，如NADH、NADPH、FMN、FAD等都能发出荧光。,（3）酶偶联分析法(enzyme coupling assay),第一个酶的产物为第二个酶的底物，这两个酶系统在一起反应。,（4）电化学法（electrochemical method）,

55、第八节 酶与医学的关系,一、酶与疾病的发生 有的疾病的发病机制直接或间接与酶的异常或酶活受抑制有关。酪氨酸酶缺乏引起白化病；苯丙氨酸羟化酶缺乏产生苯酮酸尿症；急性胰腺炎与胰蛋白酶原在胰腺中被激活有关。 激素代谢障碍或维生素缺乏可引起某些酶的异常。如VK缺乏 酶活性受到抑制多见于中毒性疾病。如有机磷农药中毒、重金属盐中毒。,二、酶与疾病的诊断,某些组织器官受到损伤造成细胞破坏或细胞通透性增加，细胞内的某些酶 可大量释放入血。如急性胰腺炎时血清和尿中的淀粉酶活性升高；急性肝炎或心肌炎时血清转氨酶活性升高。 细胞的转换率增高或细胞的增殖增快，其特异的标志酶可释放入血。如前列腺癌病人可有大量酸性磷酸酶

56、释放入血 酶的合成或诱导增强。如胆管堵塞时胆汁的反流可诱导肝合成大量的碱性磷酸酶；巴比妥盐类或酒精可诱导肝中的谷氨酰转移酶生成增多。,三、 酶与疾病的治疗 许多药物可通过抑制生物体内的某些酶来达到治疗的目的。如磺胺类药物，氯霉素，氨甲喋呤等等。,1、酶能加速化学反应的进行是由于哪一种效应 A、向反应体系提供能量 B、降低反应的自由能变化 C、降低反应的活化能 D、降低底物的能量水平 E、提高产物的能量水平 2、已知某种酶Km值为0.05mol/L，试问要使此酶所催化的反应速度达最大反应速度的80%时底物浓度应是多少 A、0.04mol/L D、0.05 mol/L B、0.8 mol/L E、

57、0.1 mol/L C、0.2 mol/L,习 题,3、向酶促反应体系中增加酶的浓度时，可出现下列哪一种效应 A、不增加反应速度 B、1/S对1/V作图所得直线的斜率减少 C、Vmax保持不变 D、v达到Vmax/2时的底物浓度增大,习 题,习 题 4、一个酶作用于多种底物时，其天然底物Km值应是 A、增大 B、与其他底物相同 C、最小 D、居中间 E、与Km相同 5、丙二酸对琥珀酸脱氢酶的抑制效应是 A、Vmax降低，Km值不变 B、Vmax降低，Km值降低 C、Vmax不变，Km值增加 D、Vmax不变，Km值降低 E、Vmax降低，Km值增加,习 题,6、酶的非竞争性抑制剂对酶促反应的影

58、响是 A、有活性的酶浓度减少 B、有活性的酶浓度无改变 C、Vmax增加 D、使表观Km值增加 E、使表观Km值变小 7、下列哪一个维生素能被氨喋呤及氨甲喋呤所拮抗 A、维生素B6 B、叶酸 C、维生素B2 D、维生素B1 E、遍多酸,8、反应速度为最大反应速度的80%时，Km等于 A、S B、1/2S C、1/4S D、0.4S E、0.8S 答案：1、C 2、C 3、B 4、C 5、C 6、A 7、B 8、C,习 题,习 题,A、丙二酸 B、敌百虫 C、路易士气 D、二巯基丙醇 E、琥珀酸 1、琥珀酸脱氢酶的竞争性抑制剂是 2、巯基酶中毒的解毒剂为 3、胆碱酯酶的抑制剂为 4、有毒的砷化物之一为,习 题,名词解释 别构调节 酶的活性中心 同工酶 酶原 简答题： 磺胺药的作用机制，并解释为什么磺胺药在体内必须达到一定的浓度。,