医学硕士答辩-欧琴答辩

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1、EBV LMP2 B细胞表位的预测、克隆、表达及其融合蛋白免疫原性的初步研究,温州医学院2004级硕士学位论文答辩,答辩人：欧 琴 导 师：张丽芳 教授 夏克栋 教授 专 业：病原生物学 2007.5.17,主 要 内 容, 研究背景 研究目的 研究方案 结 果 分析与讨论 结 论,研 究 背 景,EB病毒(Epstein-Barr virua,EBV)属于疱疹病毒科。引起的主要疾病包括传染性单核细胞增多症、移植后淋巴细胞增多症(PTLD)、霍奇金病、Burkitt淋巴瘤以及鼻咽癌(NPC)。,研 究 背 景,肿瘤 亚型 EBV阳性率,表1 EBV相关的增生性疾病,Burkitt淋巴瘤 E-B

2、L 100% S-BL 15%-85% AIDS-BL 100% NPC 低分化或未分化 100 霍奇金病 mc/ld 80%-90% ns 30 T细胞淋巴瘤 fatal IM 100% AILD 40% 淋巴母细胞瘤 fatal IM 100% 与器官移植相关 100 与AIDS相关 70-80%,研 究 背 景,LMP2不是转化基因，维持EBV潜伏感染。 LMP2成为NPC等EBV相关肿瘤治疗的理想 靶抗原之一。,研 究 背 景,表位疫苗是目前研制感染性疾病与恶性肿瘤疫苗的方向。 多表位疫苗能选择性诱导多价、多特异性应答和控制免疫应答类型。,研 究 背 景,NPC患者血清中能检测LMP2

3、抗体。 B细胞表位的研究为单克隆抗体的制备提 供更充分的依据，以B细胞表位为基础的多肽 抗原可用于血清学检测。,研 究 目 的,1. 预测EBV LMP2的B细胞表位，可为其单克隆抗体的制备及表位疫苗设计等研究提供理论依据。 2. 分别构建含预测B细胞表位多肽的原核重组质粒，采用6个组氨酸标签(His.tag)表达表位融合蛋白，并用Ni-NTA树脂亲和层析法分别纯化表位融合蛋白。 3. 将纯化的蛋白分别免疫小鼠，检测其诱导小鼠产生的特异性IgG抗体；选择抗原性强的融合蛋白作包被抗原，用ELISA检测NPC组、CA疾病对照组和健康对照组的血清特异性抗体。为B细胞表位多肽的免疫原性和抗原性及其在N

4、PC血清学诊断中的应用价值进行初步探讨。,研 究 方 案,一、EBV LMP2的二级结构分析 和B细胞表位预测,研 究 方 案,采用EXPASY服务器提供的SwissProt蛋白质数据库检索 LMP2完整蛋白质的氨基酸序列 (http:/www.expasy.org/sprot/); 采用EXPASY服务器提供的SOPMA、GOR、nnPredict、HNN方法 预测LMP2二级结构(http:/www.expasy.ch/tools) ； 采用EXPASY服务器提供的SOSUI方法预测LMP2跨膜区域 (http:/www.expasy.ch/tools) ； 采用EXPASY服务器提供的H

5、opp 2. pET32a/ozlf-67; 3:pET32a/ozlf-67/EcoR I; 4:pET32a(+); 5:pET32a(+)/EcoR I,图5 重组质粒pET32a/ozlf-69酶切鉴定 1:DNA/Hind DNA Marker; 2. pET32a/ozlf-69; 3:pET32a/ozlf-69/EcoR I; 4:pET32a(+); 5:pET32a(+)/EcoR I,图6 重组质粒pET32a/ozlf-71酶切鉴定 1:DNA/Hind DNA Marker; 2. pET32a/ozlf-71; 3:pET32a/ozlf-71/EcoR I; 4:

6、pET32a(+); 5:pET32a(+)/EcoR I,重组质粒酶切鉴定,结 果,测序结果,图7 3个重组的目的基因的测序图,结 果,B细胞表位融合蛋白鉴定,图8 B细胞表位融合蛋白表达产物 SDS-PAGE和Western-Blot分析 1:蛋白分子标准物； 2:IPTG诱导重组质粒pET32a/ozlf-67蛋白表达；3:IPTG诱导重组质粒pET32a/ozlf-69蛋白表达；4:IPTG诱导重组质粒pET32a/ozlf-71蛋白表达；5:IPTG诱导重组质粒pET32a蛋白表达； 6: BL21,结 果,ozlf-67、ozlf-69、ozlf-71融合蛋白和His蛋白的纯化,图

7、9 纯化的ozlf-67蛋白SDS-PAGE电泳分析 1：蛋白分子标准物； 2：样品穿透液； 3：Buffer B液滤液； 4：Buffer C液滤液； 5-7：Buffer E液滤液,图10 纯化的ozlf-69蛋白SDS-PAGE电泳分析 1：蛋白分子标准物； 2：样品穿透液； 3：Buffer B液滤液； 4：Buffer C液滤液； 5-8：Buffer E液滤液,图11 纯化的ozlf-71蛋白SDS-PAGE电泳分析 1：蛋白分子标准物； 2：样品穿透液； 3：Buffer B液滤液； 4：Buffer C液滤液； 5-6：Buffer E液滤液,图12 纯化的His蛋白SDS-P

8、AGE电泳分析 1：蛋白分子标准物； 2：样品穿透液； 3：Buffer B液滤液； 4：Buffer C液滤液； 5：Buffer E液滤液,结 果,结 果,三、EBV LMP2 B细胞表位融合 蛋白免疫原性的初步研究,结 果,图13 不同免疫原在不同时间的抗体均值（XSD）,分别包被3种表位融合蛋白ozlf-67、ozlf-69和ozlf-71，分别 检测3种表位融合蛋白的免疫血清与His蛋白免疫血清的抗体效 价差异。,结 果,图14 多肽表位诱导鼠免疫血清的抗体效价的ELISA检测结果,*,* ：与His蛋白免疫组比较,*,*,结 果,B95.8细胞作为包被抗原，ELISA检测3种表位融

9、合 蛋白免疫小鼠制备的鼠血清抗体效价。,图15 B95.8细胞包被ELISA检测鼠免疫血清抗体效价,* ：与His蛋白免疫组比较,*,*,*,结 果,选用Ozlf-67融合蛋白为诊断抗原，ELISA检测NPC组、 CA疾病对照组及健康对照组血清特异性IgG抗体。,图16 ozlf-67蛋白包被ELISA检测病人血清抗体效价,* ：与正常组比较,*,结 果,表5 ozlf-67蛋白包被ELISA检测病人血清抗体阳性率,*,*与正常组比较,*,分 析 与 讨 论,预测的B 细胞表位是线性B 细胞表位，主要 的参数有二级结构、跨膜区、亲水性、表面可及 性、抗原性以及柔韧性等，抗原性和亲水性是形 成表

10、位的首要条件，因而优势表位的形成是多种 因素综合作用的结果。,分 析 与 讨 论,采用分子生物学方法分别得到了包含预测 表位片段的重组质粒，并得到了融合蛋白，为 进一步表位融合蛋白的免疫学检测奠定基础。,分 析 与 讨 论,3种表位融合蛋白均具有良好的免疫原性 B细胞表位多肽均能诱导产生特异性抗体 以B95.8细胞作为抗原包被酶标板， B细胞表位 融合蛋白诱导的小鼠免疫血清与EBV抗原特异 性结合，但抗体效价较低，可能是由于单个表位 肽的结合能力较弱。,分 析 与 讨 论,选用Ozlf67融合蛋白为诊断抗原，ELISA检测NPC患者血清特异性抗体，用于NPC的血清学诊断试剂的研制具有临床应用价

11、值。,结 论,1.预测EBV LMP2的B细胞表位可能位于其N端199209、318322和381391区段； 2. 分别成功构建了含B细胞表位的重组质粒pET32a(+)/ozlf-67、pET32a(+)/ozlf-69和pET32a(+)/ozlf-71；在原核表达系统内分别高效表达了表位融合蛋白ozlf-67、ozlf-69、ozlf-71；通过亲和层析法得到了纯化的表位融合蛋白。 3. 表位融合蛋白免疫小鼠血清学检测，表明3个B细胞表位融合蛋白均能刺激机体产生抗体，具有较强的免疫原性，抗体效价随免疫次数增加而升高；表位融合蛋白诱导所产生的抗体均能与EBV抗原结合。 4.Ozlf67蛋

12、白作为诊断抗原，具有较强的抗原性，用于NPC的血清学诊断试剂的研制具有临床应用价值。,首先我要衷心感谢我的导师张丽芳教授、夏克栋教 授三年来对我的悉心指教和无私关怀。本文是在导师的 悉心指导和严格要求下得以完成。在此向导师致以最诚 挚的敬意和感谢！ 感谢基础医学院微免教研室和基础医学院实验平台 全体老师给予的帮助和支持！感谢附一和附二检验科老 师给予实验的帮助！感谢师姐、师弟、师妹及我的同学 等对我实验的帮助及生活的关心！ 我要衷心感谢我的家人，他们的关心和鼓励给予我 强大的精神动力。他们为我所做的无私奉献将使我终生 感激！ 最后感谢评审委员和参与本人论文答辩的各位专家 教授在百忙之中对本文的指导！,致 谢,谢谢！,