《荧光定量PCR技术原理、方法、数据分析详述（2013.12.16）》由会员分享，可在线阅读，更多相关《荧光定量PCR技术原理、方法、数据分析详述（2013.12.16）（51页珍藏版）》请在装配图网上搜索。
1、广州维伯鑫生物科技限公司 GUANGZHOU VIPOTION BIOTECHNOLOGY CO., LTD,1,Q-PCR技术培训 匡杰斌 广州维伯鑫生物科技有限公司 技术服务部 2013.12.13 ,2,RNA提取,RNA提取方法 RNA纯度与质量考察 RNA提取常见问题及解决方案,内容概要,样品,裂解液,上层溶液,液氮研磨 或其他方法处理,抽提,细胞裂解,干燥溶解 或洗脱,离心洗涤,酒精沉淀 或介质吸附,RNA提取流程,异硫氰酸胍/苯酚法 在变性剂异硫氰酸胍的作用下，细胞被裂解，同时核蛋白体上的蛋白变性，核酸释放； 释放出来的DNA和RNA由于在特定pH下溶解度的不同而分别位于整个体系
2、中的中间相和水相，从而得以分离； 有机溶剂抽提，沉淀，得到纯净RNA。,RNA提取常用方法-裂解方式,胍盐 /-巯基乙醇 盐酸胍裂解样本 ，抑制 RNase 的活性 ； -巯基乙醇变性蛋白,组织/细胞样品RNA提取,材料： 小鼠肝脏组织,方法： Trizol 0.1g样品组织 结果：,图：小鼠肝脏组织RNA,1 2 3 4,纯度：紫外分光光度计测定所提总RNA在260nm和280nm波长处的光吸收，以A260/A280的比值来判断总RNA的纯度。 蛋白中trp、tyr、phe的吸光度为280nm，所以280nm常用 来表示蛋白质吸光度；而260nm为核酸的吸光度。 理论上，纯的RNA情况下：O
3、D260/OD280的值为2，纯的DNA情况下：OD260/OD280的值为1.8。 实际所用RNA应处于1.8-2.0之间，最好是1.9-2.0之间。 质量：甲醛变性琼脂糖凝胶电泳鉴定。,RNA纯度与质量考察,RNA提取常见问题及解决方案,RNA 的降解 OD260 /OD280 比值偏低 电泳带型异常 下游实验效果不佳,RNA的降解,新鲜细胞或组织： 裂解液的质量 外源RNase的污染 裂解液的用量不足，组织裂解不充分 另外某些富含内源酶的样品 (如脾脏等)，很难避免 RNA 的降解。 在液氮条件下将组织碾碎，并且匀浆时使用更多裂解液。,RNA的保护,采集样品的保护： 通常用液氮保存 样品
4、保护剂RNAfixer或RNAlater,样品浸泡其中可以在37保存一天，25一周，4一个月，-20一年左右。,环境中RNase的清除： DEPC处理各种实验器具 RNAsafe对溶液中RNase进行清除。 RNA酶喷雾清除剂，可对固体表面的RNase起到清除的作用，更大程度上避免RNase的污染。,蛋白质污染： 不要吸入中间层及有机相，加入氯仿后首先混匀，并且离心分层的离心力和时间要足够。 减少起始样品量，确保裂解完全、彻底 解决办法:重新抽提一次，再沉淀，溶解。 苯酚残留： 不要吸入中间层及有机相，加入氯仿后首先混匀，并且离心分层的离心力和时间要足够。 解决办法:重新抽提一次，再沉淀，溶解
5、。,OD260 /OD280 比值偏低,OD260 /OD280 比值偏低,抽提试剂残留： 确保洗涤时要彻底悬浮 RNA，并且彻底去掉 75% 乙醇。 解决办法:再沉淀一次后，溶解。 设备限制： 测定OD260 及OD280 数值时，要使OD260 读数在 0.10 - 0.50 之间。此范围线性最好。 用水稀释样品： 测 OD 时，对照及样品稀释液使用 10 mM Tris，pH 7.5。用水作为稀释液将导致比值的降低。,非变性电泳： 上样量超过 3g，电压超过 6V/cm，电泳缓冲液陈旧，均可能导致 28S 和 18S 条带分不开。 变性电泳条带变淡： EB 与单链的结合能力要差一些，故同
6、样的上样量，变性电泳比非变性电泳要淡一些； 甲醛的质量不高 。,电泳条带异常,荧光定量PCR,RT-PCR原理 Real-time qPCR原理及应用 Real-time qPCR成功关键 Real-time qPCR数据分析 Real-time qPCR常见问题及解决方案,主要内容,逆转录PCR，将mRNA逆转录后在进行PCR扩增，产物通过电泳检测基因的表达情况，又称半定量PCR。 主要用于定性检测。,RT-PCR,RT-PCR原理 Real-time qPCR原理及应用 Real-time qPCR成功关键 Real-time qPCR数据分析 Real-time qPCR常见问题及解决方
7、案,实时荧光定量PCR技术的应用,基因表达差异分析 拷贝数分析 SNP检测 miRNA定量 转基因成分定量分析 临床诊断、疾病及药物研发等,绝对定量VS相对定量,绝对定量： 此方法是用一系列已知浓度的标准品制作标准曲线，在相同的条件下目的基因测得的荧光信号量同标准曲线进行比较，从而得到目的基因的量。该标准品可以是纯化的质粒DNA，或其他已知拷贝数的DNA。 应用：单位体积（质量）样本内的DNA（RNA）含量测定:病毒核酸含量测定；环境水质病原体含量测定等。 相对定量： 通过与内参基因Ct值之间的相差来计算基因表达差异,一般是 2-Ct 。 应用：某个基因在处理组（某个条件的不同处理时间、不同处
8、理强度等）相对于对照组（不处理）的表达差异。,Real-time qPCR原理,如何对初始模板定量 荧光信号如何产生？,Real-Time qPCR主要概念,Real-Time qPCR曲线的意义,扩增曲线,熔解曲线,图片为：首都医科大学演示实验结果 材料：小鼠肝脏 基因：-actin,实时荧光定量 PCR 的化学原理包括探针类和非探针类两种。 非探针类则是利用荧光染料（如SYBR Green I）或者特殊设计的引物(如LUX Primers)来指示扩增的增加。 探针类(TaqMan探针和 分子信标)是利用与靶序列特异杂交的探针来指示扩增产物的增加。 后者由于增加了探针的识别步骤，特异性更高，
9、但前者则简便易行。,荧光染料和荧光探针,SYBR Green I 工作原理,SYBR Green I是一种结合于小沟中的双链DNA结合染料，与双链DNA结合后，其荧光大大增强。这一性质使其用于扩增产物的检测非常理想。 在PCR反应体系中，加入过量 SYBR 荧光染料，SYBR荧光染料特异性地掺入DNA双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的 SYBR 染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。,TaqMan探针工作原理,F,Primer,Primer,Degradation of TaqMan probe by DNA polymerase,Reporter,
10、Quencher,Suppression of fluorescence,荧光阈值(Threshold),Ct,Ct值是扩增DNA的量达到阈值时候的循环次数。,Ct 值与起始模板的关系研究表明，每个模板的 Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多， Ct值越小。 利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，其中纵坐标代表起始拷贝数的对数，横坐标代表 Ct 值（如图所示）。因此，只要获得未知样品的 Ct 值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。,Ct值,RT-PCR原理 Real-time qPCR原理及应用 Real-time qPCR成功关键 Real-time qP
11、CR数据分析 Real-time qPCR常见问题及解决方案,Real-time qPCR成功因素,引物设计： 3末端尽量不是A； 1824bp；扩增产物80-150bp; 设计在基因保守区内 Taqman探针：尽量靠在上游引物；长度3045bp，Tm比引物高至少 5；5端不要是G，G会有淬灭作用，影响定量 RNA质量和定量 比较好，2条主带可见（28s和18s）；定量准确 内参（housekeeping gene）正确选择 18s rRNA, -actin, GAPDH等 标准曲线的准确制作R20.99,反应体系： 模板浓度不要太高，反转录最多1g总RNA， PCR一般1L反转录产物； 引物
12、浓度一般100nM-1mM； 根据kit要摸索最佳反应条件 小心操作： 每管或每孔都要换新枪头！不要连续用同一个枪头加样，即使是混 合液！每个样品至少要做3个平行孔。每组实验最好有3个重复，做统计 分析。,Real-time qPCR成功因素,做real-time qRT-PCR前，做个普通的PCR，检测您的反应条件！,RT-PCR原理 Real-time qPCR原理及应用 Real-time qPCR成功关键 Real-time qPCR数据分析 Real-time qPCR常见问题及解决方案,Real-time qPCR数据分析,基线（baseline） 通常是315个循环的荧光信号 同
13、一次反应中针对不同的基因需单独设置基线 阈值（threshold) 自动设置是3-15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍 手动设置：置于指数扩增期，刚好可以清楚地看到荧光信号明显增强。 同一次反应中针对不同的基因可单独设置阈值， 但对于同一个基因扩增一定要用同一个阈值。 Ct值 :与起始浓度的对数成线性关系 分析定量时候一般取Ct:15-35.太大或者太小都会导致定量的不准确。,绝对定量,统计分析方法,绝对定量数据分析,注：1、“？”已知； 2、“？”可通过图中公式算出； 3、“？”可通过“？”与“？”算出。,相对定量,相对定量数据分析,实时检测（在对数扩增时期）而不是终点检测 敏感性高 需要
14、样品少 特异性高（Taqman） 精确定量,Real-time qRT-PCR优点,RT-PCR原理 Real-time qPCR原理及应用 Real-time qPCR成功关键 Real-time qPCR数据分析 Real-time qPCR常见问题及解决方案,特异性 重复性 灵敏度 其他问题,常见问题讨论,扩增的特异性,引物？,Tm，重新设计引物，优化条件,Tm,重复性-判断实验优劣的重要指标,判断指标：主要为标准差（SD） 影响重复性的因素： PCR 反应扩增的效率：优化实验条件，使反应体系达到最佳扩增效率 。 目的基因的初始浓度： 使用初始浓度具有较高数量级的样本或作平行孔。 标准曲
15、线的影响：不少于5个稀释度的标准品，涵盖待测样本中目的基因量可能出现的全部浓度范围。,影响灵敏度的因素,反应体系中形成的引物二聚体的影响 可以用水解探针代替SYBR Green I，有文献报导使用水解探针的敏感性要比SYBR Green I高出10倍。 可以使用热启动办法或使用特殊处理的Taq酶 要尽可能地优化引物设计 注意避免室温混合各种试剂，并且在一经混合后立即开始进行扩增。 循环数 Mg2的浓度 一般来讲，适当调高镁离子浓度有助于提高Taq酶活性，也就是提高PCR效率，但会降低PCR特异性，也就是说可能会有更多杂带。适当降低镁离子浓度则可提高特异性。所以，在实际实验中，可摸索最适浓度，既
16、保证特异性又有较高酶活性,Q1:无Ct值（信号）出现,可能性不大,检测荧光信号的步骤有误: 一般SG法采用72延伸时采集，Taqman法则一般在退火结束时或延伸结束采集信号。 引物或探针降解: 可通过PAGE电泳检测其完整性。 模板量不足: 对未知浓度的样品应从系列稀释样本的最高浓度做起。 模板降解: 避免样品制备中杂质的引入及反复冻融的情况。,Q2:Ct值出现过晚（Ct35）,扩增效率低: 反应条件不够优化。设计更好的引物或探针；适当降低退火温度；增加镁离子浓度等。 PCR各种反应成分的降解或加样量的不足。 PCR产物太长: 一般采用80-150bp的产物长度。,Q3:标准曲线的线性关系不佳
17、,加样存在误差: 使得标准品不呈梯度。 标准品出现降解: 应避免标准品反复冻融，或重新制备并稀释标准品。 引物或探针不佳: 重新设计更好的引物和探针 模板中存在抑制物，或模板浓度过高。,Q4:阴性对照也出现明显的起飞,反应mix或水被污染。 引物二聚体的出现： 用SG法在35cycles以后阴性出现起飞属正常情况，可配合熔解曲线进行分析。 反应过程中探针的降解：用PAGE电泳对探针进行检测。 ROX校正的问题：如果使用了，则可能是ROX的降解所造成。,Q5:熔解曲线不止一个主峰,引物设计不够优化：应避免引物二聚体和发夹结构的出现。 引物浓度不佳：适当降低引物的浓度，并注意上下游引物的浓度配比。 镁离子浓度过高：适当降低镁离子浓度，或选择更合适的mix试剂盒。 模板有基因组的污染：RNA提取过程中避免基因组DNA的引入，或通过引物设计避免非特异扩增。,Q6:扩增效率低,反应试剂中部分成分特别是荧光染料降解。 反应条件不够优化：可适当降低退火温度或改为三步扩增法。 反应体系中有PCR反应抑制物：一般是加入模板时所引入，应先把模板适度稀释，再加入反应体系中，减少抑制物的影响。,Q7:同样的试剂在不同仪器上产生不同的曲 线，如何比较？,判断标准：扩增效率，灵敏度，特异性,谢谢大家！,
荧光定量PCR技术原理、方法、数据分析详述（2013.12.16）
