淋巴细胞转化实验.ppt

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1、细胞培养技术,2011.12.13,细胞培养概述,细胞培养（cell culture）：从体内取出组织或细胞，在体外模拟体内的生理环境，在无菌、适宜温度和一定营养条件下使其生长，并维持其结构和功能的方法。 细胞培养技术是生命科学中常用的研究手段，亦是生命科学各研究领域的基础技术和基本技能。,细胞培养实验的基本要求,实验前准备：超净台紫外线消毒30min；无菌室每周消毒1-2次；所用器材要经过严格消毒；操作前用消毒液浸泡手或用75%酒精擦拭。,实验中要求： 一切操作均要在火焰前方进行；瓶口、吸管使用前要经过火焰消毒后使用。 试剂瓶的瓶口应斜放在支架上，试剂用后立即封闭瓶口。 专管专用。 手不要从

2、敞开的瓶口上方经过。 换液时，吸取培养基的吸管不要触及细胞培养瓶瓶口，以免把细胞带到培养液中污染其他细胞; 细胞一旦购置或从别处引入，均应及早留种冻存，一旦发生污染可重新复苏培养,实验后要求： 关闭超净台风机；用酒精纱布擦拭超净台台面，紫外线消毒。,细胞培养条件,合成培养基：根据体内细胞生存所需的物质种类和数量，用化学物质模拟合成。 常用的培养基有RPMI-1640、DMEM、IMDM等。 血清：胎牛血清、新生牛血清、小牛血清。 抗菌素：抑制可能存在的细菌和霉菌的生长，而不影响细胞的生长。 常用青、链霉素；庆大霉素等。 消化液（培养贴壁细胞用）：0.25%胰蛋白酶、EDTA液 pH调整液 Na

3、HCO3溶液：常用浓度为5.6%和7.4% Hepes液：可较长时间保持较强的缓冲作用 培养条件：无菌、,细胞培养基本技术,细胞原代培养：从供体获取组织细胞的首次培养。原代细胞离体时间短，在一定程度上能反映体内的生长特性。适合作药物测试、细胞分化和转化等实验研究。 细胞传代培养：原代培养细胞长到一定密度时，需进行传代培养。 悬浮生长细胞传代：离心法 半悬浮生长细胞传代：直接吹打法 贴壁生长细胞传代：胰酶消化法,细胞的冻存、复苏与运输,细胞的冻存 10DMSO（低温保护剂），20以上的血清，其余为培养基，细胞数1106个-1107个。二步冻结法。,细胞的复苏 从液氮罐中取出的冻存管，迅速投入37

4、水浴中充分摇动，使其迅速融化。加入培养液离心后，弃上清，加培养液培养。,细胞的运输 长距离运输：补充培养液至瓶颈部，保留微量空气，拧紧瓶盖；瓶口用胶带密封，并用棉花包裹作防震、防压处理。,细胞培养常见污染及处理方法,细菌污染,处理: 将污染孔内液体弃掉，加入硫酸铜或5mol/L NaOH; 重要克隆洗涤数次后,大剂量联用抗生素效果较好; 反复洗涤后注射到小鼠腹腔中(限用于某些细胞),培养液变混浊，pH改变;细胞发生病理改变，胞内颗粒增多、增粗，最后变圆脱落死亡。,处理: 应用达克宁、咪唑康； 处理CO2孵箱,真菌 污染,培养液中漂浮着白色或浅黄色的小点，培养液一般不发生混浊；镜下可见丝状、管状

5、或树枝状的菌丝纵横交错在细胞之间，有的呈链状排列;细胞生长变慢，最后由于营养耗尽及毒性作用而使细胞脱落死亡。,支原体 污染,难发现,难去除; 预防为主 新一代支原体抗生素可杀灭支原体,一般过滤除菌无法去除，光镜下难以看清形态结构; 能在偏碱条件下生存; 对青霉素有抗药性; 多吸附于细胞表面或散在于细胞之间; 多数细胞污染后无明显变化,如果发现破碎的细胞甚多，培养细胞需要频繁改善营养环境才能支持长期传代培养时，应该怀疑支原体污染,扫描电镜法显示支原体，附于细胞表面众多的圆形颗粒为支原体,处理: 更换血清; 增加细胞的接种密度，以提高细胞的生存率,黑胶虫 污染,可以穿过滤膜. 低倍镜下为黑色点状,

6、高倍镜下可见黑点游动;培养液一般不受影响;细胞增殖旺盛时可自然消失,淋巴细胞转化实验,2010.12.21,淋巴细胞在体外培养时，受到刺激剂的刺激后可表现为细胞体积增大、代谢旺盛、蛋白质和核酸合成增加，即向淋巴母细胞转化和增殖。此现象称为淋巴细胞转化现象（简称为淋转）。 淋巴细胞转化率的高低可以反映机体的免疫水平，因此可作为测定机体免疫功能的指标之一。,原理,T细胞、B细胞表面具有抗原识别受体和有丝分裂原受体 植物血凝素（PHA）、刀豆蛋白A（ConA）可选择性刺激T细胞增殖； 脂多糖（LPS）可刺激B细胞增殖；,作用于人和小鼠T/B淋巴细胞的重要丝裂原,分离人外周血单个核细胞（PBMC） 分

7、离人淋巴细胞(磁珠分离，流式细胞术) 淋巴细胞转化试验,实验流程,实验流程PBMC的分离,基本原理：由于血液标本中各种细胞比重不同，红细胞、中性粒细胞比重为1.092，单个核细胞（淋巴细胞和单核细胞）比重为1.0751.090；Ficoll比重为1.0770.001。将血液标本置于分层上，经离心沉淀，比重高的红细胞、多核白细胞沉于管底，而比重小的淋巴细胞和单核细胞悬浮于血浆和分层液的界面层中。,淋巴细胞分离液,红细胞、粒细胞、血小板,血浆,实验流程淋巴细胞转化实验,基本原理： 在特异性抗原刺激下可使相应淋巴细胞克隆发生增殖； 有丝分裂原可作为多克隆刺激剂，使相应淋巴细胞发生增殖。,形态计数法、

8、MTT法、CCK-8法、同位素法。 （一）形态计数法：计数淋巴母细胞的比例，计算转化百分率。 （二）MTT法：MTT是一种噻唑盐。活细胞内线粒体琥珀酸脱氢酶以MTT为底物，形成蓝色的甲臜（Formazan）颗粒沉积于细胞内或细胞周围，经溶解后为紫色溶液，可用酶标测定仪测定OD570的值。,实验流程结果观察,（四）3H-TdR 掺入法：3H-TdR即胸腺嘧啶核苷，是DNA合成的前体。加入细胞培养液中后被细胞摄取作为DNA合成的原料。细胞合成的DNA越多，则所掺入的3H-TdR就越多。该方法与MTT比较，灵敏度高、准确性好。,（三）CCK-8(Cell Counting Kit-8)法:原理同法。

9、是的升级替代产品，可被还原成橙黄色的甲臜，且为水溶性。本方法重复性好，灵敏度高，对细胞的毒性低。,实验流程结果观察,取静脉血3ml,用PBS（吸管1）稀释1倍（滴管1） （共6ml） 将稀释好的静脉血沿管壁缓慢加入到淋巴细胞分离液（3ml）的上方（滴管1）,2000rpm,20min 将滴管（滴管2）插入到白膜层，吸取单个核细胞层，转移至另一离心管中，加入PBS （吸管1）至5ml,1500rpm,10min.弃上清，再洗涤细胞1次（吸管1） （滴管2）.离心之前计数细胞 弃上清,加入完全培养基（吸管2）,重悬细胞（滴管2）.将细胞浓度调整为2*106个/ml. 将细胞加入96孔板（加样枪）,

10、100ul/孔 A组：加入不同浓度的ConA,100ul/孔.每个浓度为2复孔.留2个孔仅加入培养基，作为空白对照. B组：加入100ul ConA(10ug/ml),则终浓度为5ug/ml.4复孔.设空白对照.,实验步骤,A组：置培养箱中培养66h,加入MTT溶液20ul/孔,继续培养6hr后,去掉上清,加入DMSO100ul/孔,弃分混匀,测OD570nm值. B组：置培养箱中培养66h，制备流式标本，上机检测,ConA的倍比稀释,10ug/ml,5ug/ml,2.5ug/ml,450L,440L,220L,220L,Original sample tube,tube 1,tube 2,220L,ConA 20ug/ml 250ul 加250ul全培,注意无菌操作 操作中尽可能短时间内完成，以减少死细胞数 将稀释血加于分离液时，动作要轻柔 离心时，加速度与减速度要均匀平稳，不能用离心机“刹车”档 分离不同种属动物的PBMC要用不同的淋巴细胞分离液 细胞数量、刺激剂浓度需要在预实验中摸索最适条件,注意事项,谢谢,